탈착 및 소프트 이온화로 생성된 스펙트럼 특성화
결합을 끊거나 분해하거나 절단하여 잘 특성화된 특정 조각화를 얻는 데 필요한 역 Diehls–Alder 반응 및 용혈/이종 분해 에너지는 질량 스펙트럼을 다룰 때 논리적 판단의 기초로서 여전히 활용됩니다. MS에서 어려운 부분은 해석 규칙을 이해하는 데 중요한 기여를 한 사람 중 한 명인 프레드 맥라퍼티(Fred McLafferty)가 제기한 질문에 답하는 것입니다. "우리는 어떤 질량을 다루고 있는가?"
MALDI(matrix-assisted, laser-desorption ionization, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화) 및 전자 분무와 같은 탈착 기술이 개발될 때까지 이 질문에 답하는 것은 적어도 이따금 쉬운 것처럼 보였습니다. 얼마나 쉬운지는 샘플이 휘발성이고 GC-MS에 적합하도록 만들기 위해 유도체화가 필요한지에 달려있습니다. 여기서 스펙트럼은 유도체화된 그룹으로 지배되고 분자 이온이 거의 또는 전혀 나타나지 않는 경우가 많습니다(따라서 CI가 필요함). 이 경우 전기 분무와 APCI의 등장은 1가 전하를 가진 저분자의 분자량을 확인하는 데 확실히 도움을 주었습니다. 적어도 이러한 경우 MS는 단일 전하만 표시하는 이온의 m/z 값을 처리했습니다. 분석물의 질량은 일반적으로 분자 이온의 공칭 질량(공칭 m/z 값)으로 보고되고 분자의 공칭 질량과 동일합니다. 이온, 분자 또는 라디칼의 공칭 질량은 원소 조성에 있는 원소의 공칭 질량의 합계입니다. 그만큼 원소의 공칭 질량은 가장 존재비가 높고 자연적으로 발생하는 안정적인 동위원소의 정수 질량입니다.
그러나 전기 분무 이온화(ESI)와 같은 소프트 이온화 탈착 기술이 1990년대 초부터 상업적으로 널리 보급되면서 그 대답은 더욱 어려워졌습니다. MS의 "탈착 전" 시대에 MS를 통해 조사한 대부분의 분석물의 공칭 질량은 500Da 미만이었습니다. 수소의 존재로 인한 질량 결손은 이러한 분석물에는 문제가 되지 않았습니다. 대부분의 질량분석기의 상한 m/z는 650–800 범위였습니다. 따라서, 탈착 전 이온화 시대에는 공칭 질량과 정수 단일 동위원소 질량이 동일한 값을 가졌습니다. 이온, 분자 또는 라디칼의 단일 동위원소의 질량은 원소 조성에 있는 원소의 단일 동위원소 질량 합계입니다. 그만큼 원소의 단일 동위원소 질량은 가장 존재비가 높고 자연적으로 발생하는 안정적인 동위원소의 정확한 질량(exact mass)입니다.
탈착 이온화 시대에 접어들면서 기술적인 장벽이 사라진 만큼, 고분자와 더 높은 정밀도가 연구에 필수적인 요소가 되었습니다. 이렇게 되면서 질량 결손 문제가 매우 중요해졌습니다. 가장 가까운 정수 m/z 값으로만 보고할 수 있는 질량분석기의 경우, C50H102 화합물의 분자 이온은 그 피크가 m/z 702가 아닌 m/z 703에 나타날 수 있는데, 이는 분자 이온의 단일 동위원소 질량이 702.7825이고 703으로 반올림되기 때문입니다.
500Da 이상에서 질량 결손은 MS 피크의 m/z 값을 결정할 때 심각한 문제가 될 수 있습니다. 질량분석기는 사용되는 m/z 분석기의 종류에 관계없이 질량 스펙트럼을 수집하는 동안 특정 시간에 발생하는 신호 강도를 측정한다는 점을 염두에 두어야 합니다. 보고된 m/z 값은 특정 화합물에 의해 생성된 알려진 m/z 값의 이온이 검량 화합물과 비교하여 상대적으로 검출기에 도달하는 시간의 함수입니다.
m/z 스케일의 위치가 변경되면 단일 동위원소 이온의 질량이 변하기 때문에 정수 m/z 값을 보고하는 질량분석기는 실제로 0.05m/z 단위마다 측정을 수행할 수 있습니다. 검출된 강도는 질량 스펙트럼 피크의 정점에서의 강도 또는 질량 스펙트럼 피크 전체 강도의 합일 수 있습니다. 보고된 m/z 값은 질량 스펙트럼 피크 최대값에 대해 관찰된 m/z 값을 반올림하여 얻어지는 정수입니다.
전자 이온화 MS에서는 m/z 스케일을 검량하기 위해 퍼플루오로트리부틸아민(공칭 분자량 671)과 같은 과불소화 화합물을 이용하는 경우가 많습니다. 이온의 정수 질량이 단일 동위원소 질량과 거의 동일하기 때문입니다. 이온이 1000Da의 공칭 질량을 초과하면 질량 스펙트럼에서 공칭 m/z 값 피크가 관찰되지 않습니다. 단일 동위원소 질량 피크는 공칭 질량 피크를 이온의 질량 결손과 동일한 양으로 관찰해야 하는 위치에서 상쇄됩니다. 500Da 이상의 질량을 가진 1가 이온의 경우, m/z 스케일 전체에서 단위 분리능을 갖는 투과 Quadrupole 또는 Quadrupole 이온 트랩 질량분석기에서 전기 분무와 같은 기술을 사용하여 동위원소 피크를 명확하게 분리할 수 있습니다.
화합물의 성분을 식별하는 데 동위원소가 어떤 역할을 하는지에 대한 많은 논의들 중 하나가 LCGC Europe에 제기되었으며 이를 통해 균형을 보다 잘 이루게 되었습니다. "저분자 ILC–MS의 동위원소 피크 해석"(LM Hill, LCGC Europe 19(4), 226–238(2006))은 저분리능 이온 트랩 연구를 기반으로 합니다. 관련 부분에서 저자는 이온 트랩을 사용할 때 다음과 같이 과도한 확신을 경고합니다. "[I]트랩 사용자는 QTOF 또는 Triple Quadrupole 시스템을 사용할 때보다 더욱 신중해야 합니다. 오염이 없는 분리된 +1 동위원소 피크에서 시작해야 합니다... 이온 트랩은 스캔하는 것보다 낮은 분리능으로 트랩하는 경향이 있습니다... 트랩을 비우면서... 질량 순서로..." 이것은 이온 트랩을 사용할 수 없다는 것을 의미하지는 않지만 다른 모든 기기들과 마찬가지로 그 능력과 한계에 대한 이해가 바탕이 되어야 함을 강조합니다.
마찬가지로 매우 높은 분리능을 제공하는 기기라도 자동으로 해답을 제공하지는 않습니다. Kind와 Fiehn—T. Kind 및 O. Fiehn, BMC Bioinformatics 7, 234(2006)의 논문에 제시된 하나의 데이터 세트는 특히 주목할 만한 결과를 보여주며 160만 개의 화학식 검색 결과에 대한 조사를 바탕으로 다음과 같은 결론을 내렸습니다: "높은 질량 정확도(1ppm)와 높은 분리능만으로는 충분하지 않습니다... 동위원소 존재비 패턴 필터만이 가능한 화학식 후보의 수를 줄일 수 있습니다." 질량 정확도는 3ppm에 불과하지만 동위원소 패턴 정확도가 2%인 질량분석기는 일반적으로 잘못된 후보값의 95% 이상을 제거합니다. 이러한 성능은 동위원소 패턴 기능이 없는 0.1ppm 사양의 질량분석기(이러한 기기가 실제로 존재한다면) 성능도 능가할 것입니다.
150Da와 900Da의 질량 사이에서 질량 정확도로 나열한 가능한 화학식의 수는 동위원소 존재비 정보를 사용하지 않을 경우 10ppm에서 0.1ppm으로 증가했습니다. 150Da에서 두 개 밖에 되지 않던 후보 화학식이 10ppm의 경우 900Da에서 3447로 늘어납니다. 상한(900Da)에서도 1ppm의 질량 정확도만으로 345개의 후보 화학식이 생겨납니다. 2% 동위원소 존재비 정확도를 사용하면 900Da에서 후보의 수는 18개로 줄어듭니다. 또한 5ppm 정확도와 관련된 동위원소 수집에 대해 5%의 정확도를 허용하면 196개의 후보가 산출됩니다.
