分取液体クロマトグラフィーの入門書

1. Antioxidant Isolation Using the Prep 150 LC System（Prep 150 LC システムを用いた抗酸化物質の分離）。
2. Peptide Isolation Using the Prep 150 LC System （Prep 150 LC システムを用いたペプチドの分離）。
3. Purification of Cannabinoid from Hemp Oil Using the Prep150 LC System （Prep 150 LC システムを用いたヘンプオイルからのカンナビノイドの精製）。
4. Isolation of Flavonoids from Ginko Biloba Leaf Using the Waters Prep 150 LC System（Prep 150 LC システムを用いたイチョウ（Ginko Biloba）の葉からのフラボノイドの分離）。
5. Isolation of a Natural Product from Echinacea Extract Using the Prep 150 LC（Waters Prep 150 LC を用いたエキナセア抽出物からの天然物の分離）。
6. Streamlining Compound Isolation Automatically with UPLC to Prep Chromatography Using Mass-Directed AutoPurification（質量分析計を組み合わせた AutoPurification を用いた UPLC から分取クロマトグラフィーにおける化合物分離の自動的効率化）。
7. Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector（ACQUITY QDa 検出器を用いた合成ペプチドの質量検出に基づく分離）。
8. Strategies for Improving Isolation Using Large Volume Leading and Easy Method Development in Prep Chromatography（分取クロマトグラフィーにおける大容量注入および簡易分析法開発による分離改善の戦略）
9. Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Prep Liquid Chromatography（分取液体クロマトグラフィーでの大容量注入の効率を改善する手法）
10. Mass-Directed Isolation of Sulfa Compounds from an Antibiotic Mixture with an ACQUITY QDa Detector（ACQUITY QDa 検出器を用いた抗生物質混合物からのサルファ化合物の質量検出に基づく分離）
11. Mass Directed Isolation pf a Pharmaceutical Compound Using AutoPurify™ with an ACQUITY QDa Detector （ACQUITY QDa 検出器を備えた AutoPurify™ を用いた医薬品化合物の質量検出に基づく分離）
12. Typical Conditions for Analyzing and Isolating the Compounds in the Prep Chromatography Mixture Standard with an ACQUITY QDa Detector（ACQUITY QDa 検出器を用いた分取クロマトグラフィー混合標準物質に含まれる化合物の分析と分離の一般的な条件）
13. Preparatory Chromatography of Natural Product Extracts Utilizing a UV-Based Open Access Walk-up Purification Strategy（UV ベースのオープンアクセスウォークアップ精製戦略を用いた天然物抽出物の分取クロマトグラフィー）。
14. A modular Prep HPLC System for the Isolation of Puerarin from Kudzu Root Extracts（葛根抽出物からのプエラリン分離のためのモジュラー分取 HPLC システム）。
15. Improving Resolution and Column Loading Systematically in Prep Liquid Chromatography for Isolating a Minor Component from Peppermint Extract（ペパーミント抽出物中の微量成分分離に向けた分取液体クロマトグラフィーにおける分離およびカラムローディングの系統的な改善）。
16. Small Scale Peptide and Impurity Isolation Using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager-Analytical Systems（ACQUITY UPLC H-Class システムおよび WFM-A システムによるペプチドおよび不純物の小スケール分離）。
17. Small Scale Purification of Constituents from Complex Natural Product Extracts Using ACQUITY H-Class and Waters Fraction Manager- Analytical Systems（ACQUITY H-Class システムおよび Waters フラクションマネージャーを使用した複雑な天然物抽出サンプルから分析スケールでの分取）。
18. At-Column-Dilution、アプリケーションノート、リビジョン A、Waters Corp, 2003。役に立つアプリケーションノートおよび参考文献の詳細については、www.waters.com で上記の青色のレファレンス番号を検索ボックスに入力してください。 

結論：

• At-Column-Dilution – カラムヘッドにおいてサンプルを強溶媒で希釈することにより、質量キャパシティーを増やし、分離能を向上させてカラム寿命を延ばし、LC システムの堅牢性を高める特許取得済みの注入手法。クロマトグラム – 溶出量や溶出時間に対する溶出液に含まれる分析種濃度の尺度として使用する検出器レスポンスやその他の量を、図またはその他の手段により表示したもの。カラム容量（V_c）、V_c =π × （r）² × 高さ × 66% 移動相占有容量/1000（mm³ から mL へ変換） – 検出器へのフローの小さい部分での、充塡剤を含むチューブの一部の幾何学的容量（チューブの内部断面積と充塡ベッド長（L）の積、充塡剤が占めるスペースに対する 66% 補正を含む）。一方、メインの部分がフラクションコレクターに進む間も、デュエルボリュームは存在します。ただし、移動相濃度は一定であるため、デュエルボリュームが異なるシステムで実行したクロマトグラムに違いは見られません。溶出液、溶離液、溶出物 – 溶出液とは、カラム出口から出るまたは溶出する、溶液中の分析種を含む溶離液の一部を指します。分析 HPLC では、溶出液に含まれる分析種の濃度や質量を検出器で調べます。分取 HPLC では、溶出液は、一定の時間間隔または容量間隔で連続的にアリコートとして回収する、あるいは目的のピークの存在を検出器が示したときのみ不連続的に回収します。これらのフラクションを、続いて処理して精製化合物を得ます。疎水性 – 非極性ラジカルまたは水よりも有機溶媒によく溶ける分子が持つ特性。イオン交換クロマトグラフィー – イオン交換クロマトグラフィー（イオンクロマトグラフィー）は、イオンと極性分子をイオン交換体に対する親和性に基づいて分離するクロマトグラフィープロセスです。この分離手法は、大きなタンパク質、小さなヌクレオチド、アミノ酸など、あらゆる種類の荷電分子に使用されます。 アイソクラティック – 移動相組成が、クロマトグラフィー分離の過程を通して一定です。メイクアップ溶媒 – 質量検出に基づく分取精製システムにおいて、検出器に向かう分取フローから分割されたサンプルを希釈して運ぶために使用する溶媒。移動相 – HPLC カラムから化合物を溶出するために使用する溶媒。 流速 – 単位時間内にカラムを通過する移動相の容積。インジェクター（オートサンプラー、サンプルマネージャー） – 所定量のサンプル溶液を移動相フローに正確かつ精密に導入（注入）するメカニズム。アイソクラティック溶出 – 溶出プロセスの間、移動相の組成が一定に保たれます。移動相 – 固定相の吸着剤ベッドを通過し、一定の方向に流れる流体。ピーク – 単一成分がカラムから溶出する間の検出器レスポンスの記録。分離度（Rs） – 2 つのピークの分離。それぞれのピークの保持時間の差をベースラインでの平均ピーク幅で割った値として表します。R_s = 1.25 は、等しい幅の 2 つのピークがちょうどベースラインで分離されていることを示します。R_s = 0.6 の場合、ピークの頂点の近くの小さな谷によってのみクロマトグラムに 2 つのピークが存在することを視覚的に確認できます。保持時間（RT） – 注入またはサンプル導入からピーク最大値の出現までの時間。選択性 – 分離システムを構成する特定の移動相および固定相に対する 2 つの分析種の相対的親和性の差の程度を表すのに使用される用語。スケール（スケールアップ） – 1 回の分離で得たい精製分離物の量によって、カラム径、システム、およびハードウェア要件が決まります。量は、µg レベルの小量の酵素の分離または精製から、工業規模の医薬品製造に必要な kg レベルまでさまざまです。スケールアップは、特定の化合物の潜在的価値が最初に確認された後に、さらなる評価のための化合物がさらに必要になる場合に実施します。ステップグラジエント – 緩やかな勾配のフォーカスグラジエントの部分の前後で使用される分離方法。システムのデュエルボリュームを決定する場合にもよく使用されます。シラノール – サンプルとの相互作用に利用可能なシリカ基材のカラム充塡剤に結合している化学基。スプリッター – 質量分析法を用いた精製などで、少量のサンプルフローを破壊型検出器に向けて切り替えるのに使用します。固定相 – ガラスや金属のチューブに充塡された、またはオープンチューブキャピラリーの壁を構成する多孔質固相（ガラス、シリカ、アルミニウムなど）。移動相は充塡剤ベッドまたはカラムを通過して流れ、分離対象のサンプルがカラムの最初の部分に注入され、移動相によりシステムを通過して運ばれ、異なる物質が 2 つの相に対する相対的親和性に従って分配されます。スループット – 小容量・小粒子の分析カラムまたは大容量・大粒子の分取カラムを用いて高い線速度で LC 分離を操作することのメリット。高い分離能、速い速度、および高い効率により高いスループットが得られます。1 回の分析あたり、または工程期間あたりに、より大量の化合物が精製できます。

用語集

1. システム容量 – 移動相溶媒が混合される時点からカラムヘッドに到達するまでのデュエルボリューム、遅延容量、システム容量。高圧混合 LC システムの場合、ミキサー、接続チューブ、およびオートサンプラーループという主要コンポーネントで構成され、これが実際に重要になるのは、グラジエントアプリケーションにおいてのみです。
2. スプリット比 – 質量検出に基づいた精製において、メインのサンプルフローから連続的に「取り出され」、希釈されてから検出器へと移動するフローの量。
3. サイズ排除クロマトグラフィー – 化合物を溶液中のサイズに基づいて分離するクロマトグラフィー法。
4. 緩やかなグラジエント – カラムボリュームあたりの有機溶媒組成の変化速度が遅いグラジエント。カラムマトリックスに対する親和性が類似した化合物を分離するのに使用されます。
5. セグメントグラジエント – 異なる選択性を持つ複数の化合物を最高のスループットで分離するために異なる傾きの複数のグラジエントを使用する分離法。
6. 感度（S） – 検出器に入る移動相中の物質の単位濃度または単位質量あたりのシグナル出力。質量流速を感知する検出器の場合、単位質量に対するピーク高さの比。
7. 逆相クロマトグラフィー – 移動相の極性が固定相よりも著しく高い液体クロマトグラフィーで使用される溶出手法。
8. 保持係数（k） – サンプル成分が移動相に存在している時間に対するサンプル成分が固定相に存在している時間の相対的な尺度。サンプル成分が移動相の速度でカラムを通過するのにかかる時間と比べて固定相によりどのくらい遅延するかを表します。
9. 分取クロマトグラフィー – さらなる実験や使用に十分なレベルの量および純度で化合物を分離するための液体クロマトグラフィーを用いたプロセス。
10. パッシブスプリッター – 規定のスプリット比でメインのフローまたは分取フローから連続サンプリングするのに使用される装置。質量検出に基づいた精製において検出器シグナルを管理します。
11. 液体クロマトグラフィー（LC）– 移動相が液体である分離手法。
12. インレット – 移動相フローとサンプルが入ってくるカラムベッドの端。
13. グラジエント – 2 種類（以上の）混和する溶媒成分を使用して、溶出強度が増加する移動相の相対濃度を経時的に変化。
14. 移動相モディファイヤー – 分離向上のためにクロマトグラフィー溶媒に混ぜる添加剤。
15. 質量キャパシティー – 別名「質量負荷」。目的化合物の分離が十分に維持される状態で、カラムに注入できるサンプルの最大量。
16. リニアグラジエント – 規定の期間にわたり、一定速度で移動相組成を変化させるクロマトグラフィー分離法。
17. イオン化 – 分子が電子を得たり失ったりして負電荷または正電荷を獲得してイオンを形成するプロセス。
18. 親水性 – 強い極性基を持つため水や極性溶媒に簡単に溶けたり相互作用したりする性質。
19. 平衡化 – グラジエントを使用するクロマトグラフィー法では、次の注入の前にカラムとシステムを最初の移動相条件に戻すための分析後平衡化時間が必要です。十分に平衡化するためには、カラムを合計カラム容積（CV）の 5 倍でフラッシュし、加えて分析法開始条件でシステム容量（デュエル）の 3 倍でフラッシュする必要があります。Gradient Chromatography Column Re-equilibration（グラジエントクロマトグラフィーカラムの再平衡化）、Performance Perspectives、Waters Corp. 1998。 グラジエント勾配 - グラジエント分離時のカラム容積あたりの有機溶媒組成の変化率。
20. 効率 – サンプルが充塡ベッドを通過する際のサンプルバンドの拡散に抵抗するカラムの能力の尺度。効率的なカラムでは、バンド拡散またはバンドの広がりが最小限に抑えられています。効果的に分離し、感度を高め、複雑なサンプル混合物に含まれる類似の成分を同定するには効率が高いことが重要です。
21. デュエルボリューム – 移動相溶媒が混合される時点からカラムヘッドに到達するまでのシステム容量。高圧混合 LC システムの場合、デュエルボリュームは、ミキサー、接続チューブ、およびオートサンプラーループという主なコンポーネントで構成されます。移動相成分がアイソクラティック用にオンラインで混合される場合。
22. 検出器 – 物理的特性または化学的特性（UV/可視光吸収、示差屈折率、蛍光、または電気伝導度など）を測定することにより溶出液の組成変化を示す装置。一部の検出器（電気化学検出器、質量分析検出器など）は破壊型であり、サンプル成分の化学的変化をもたらします。検出器がサンプルを破壊する場合、スプリッターを用いて分流させます。
23. クロマトグラフィー – 分離する成分が、動かない固定相と固定相に対して移動する移動相という 2 つの相に分配される分離法。
24. 発色団 – 特定の波長の可視光を吸収し、他の波長は透過または反射させる分子の一部。発色団は、2 つの異なる分子軌道の間のエネルギー差が可視スペクトルにある分子領域です。したがって、発色団に衝突する可視光は、電子を基底状態から励起状態に励起させることで吸収されます。

参考文献

• 分取クロマトグラフィーは、医薬品の製造、天然物の分離、および精製物質が必要なその他の重要な業務において非常に重要な方法となっています。この方法を最大限に活用できるかどうかは、分析法開発の質に正比例します。分取システムに大スケール精製用の適切なハードウェアとソフトウェアを装備すれば、小スケールから大スケールへの分析法移管は日常的な作業になります。 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., “Natural Products Isolation” Second Edition.Humana Press.2006.
  • Aubin, A. "UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis," Waters Corporation, Milford, MA USA.2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., "Practical Chemistry Considerations for Purification."Waters Presentation.2008.
  • Dolan, J. “A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection.”Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et.al.“Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation.”Waters Corporation, Milford, MA USA.
  • "At-Column-Dilution, Application Notes", Waters Corp, 2003.
  • 役に立つアプリケーションノートおよび参考文献の詳細については、www.waters.com で上記の青色のレファレンス番号を検索ボックスに入力してください。