分取液体クロマトグラフィーの入門書

分析法のスケールアップ

分離物の潜在的価値が早い段階で実証されている場合、その分離物をさらに評価するための大量生成を目的として分離法を「スケールアップ」する場合があります。分離能などの小スケール分離での特性は大スケールでも簡単に維持できます。規定の計算式を用いて分離を高容量カラムに効果的に移行するには、流速、サンプル負荷量、およびシステムハードウェアの変更が必須です。

スケールアップの第一段階には通常、初期の生物学的評価から治療効果の高い医薬品アナログに関する構造活性関係の確立までのさまざまな用途のための、分離物のミリグラム量からグラム量までの生成が含まれます。それに続くスケールアップの段階では、前臨床開発や臨床開発のために 100 g から数キログラムを上回る量を生成し、それが成功すれば最終的には大規模な製造となります。このスケールでは、医薬品適正製造基準（cGMP）などの文書化および品質管理が関与してきます。

精製のスケール	ターゲット量	一般的なアプリケーション
分析的微量精製	µg	小スケールの創薬研究で使用される酵素や化合物の分離
セミ分取	mg	小スケールの生物学的試験代謝物の構造解析および特性解析
調製	g	分析用レファレンス標準物質毒性スカウティング試験
プロセス	kg	工業規模の医薬品や活性化合物の製造

表 3.クロマトグラフィースケール、ターゲット量、および関連アプリケーション

スケールアップのワークフローは段階的プロセスです。スケールアップの計算は正確に実施しなければなりません。正確でなければ、小スケール分離では得られていた分離能が最終結果で得られない可能性があります。分析法スケールアップの成功率を高め、保持時間および選択性を維持するには、いくつかの要件を綿密に検討する必要があります：

小スケールと大スケールでは同一の移動相が使用されていなければなりません。
同一のカラムケミストリー、長さ、および粒子径を持つカラムを用いるとスケールアップが最も簡単になります（その他の方法として、最初の分析法のカラム長と粒子径の比 L/dp が維持されている限り粒子径を変えることができます）。
サンプルは同じ濃度で、同じ希釈液で調製しなければなりません。

図 13.スケールアップのワークフロー

デュエルボリュームの決定

デュエルボリューム（遅延容量、システム容量）は、スケールアップやシステム変更の際により早く溶出するピークのピーク分離能を保つために重要です。グラジエント組成の点からカラムヘッドまでの容量として定義されます。高圧混合 LC システムの場合、デュエルボリュームは主にミキサー、接続チューブ、およびオートサンプラーループで構成されます。低圧混合システムでは、溶媒がポンプの前で混合されるため、追加のチューブとポンプヘッド（1 つまたは複数）およびミキサー、接続チューブ、およびオートサンプラーループの容量が全体的なデュエルボリュームに寄与します。

図 14.デュエルボリュームに寄与する精製流路コンポーネント（点線で囲まれた部分）

移動相成分がアイソクラティック分離のためにオンラインで混合される場合でもデュエルボリュームは存在しますが、移動相濃度が一定であるため、クロマトグラフィーで観察される変化はありません。一方、グラジエント法は、経時的な移動相濃度の変化に依存してピークを分離します。グラジエント法におけるデュエルボリュームの補正により、確実にピーク保持時間が維持されます。これは精製フラクションを分取することが目的の場合に特に重要です。

デュエルボリュームを決定するには、移動相 A および異なる UV 吸収を持つ添加剤（例えば、0.05 mg/mL ウラシル、または 0.2% アセトンのアセトニトリル溶液）を含む移動相 B 溶媒のステップグラジエントを、「分析から分取へのグラジエントカリキュレーター」（www.waters.com/prepcalculator）で紹介している方法に従って使用します。

1. カラムを取り外します。

2. 移動相 A としてアセトニトリル、移動相 B として添加剤（0.05 mg/mL ウラシルまたは 0.2% アセトン）を含むアセトニトリルを使用します。

3. UV 検出器を 254 nm に設定します。

4. デュエルボリュームを 2 回計算します（つまり、元の装置での流速と、目的の装置での目的の流速におけるデュエルボリュームを計算します）。

5. 100% A で 5 分間ベースラインのデータを収集します。

6. 5 分後に 100% B へのステップ変更をプログラムし、さらに 5 分間データを収集します。

7. 100% A と 100% B の間の吸光度の差を測定します。

8. その吸光度差の 50% になる時間を測定します。

9. ステップ開始と 50% 時点の時間差を算出します。

10. 時間差と流速を掛け算します。

表 4.デュエルボリューム決定の手順

キャパシティー

分取精製クロマトグラフィーでは、分取対象の化合物の十分な分離を維持することが第一の目的です。カラムキャパシティー（負荷量）は、目的化合物と隣接するピークとの分離に基づいて評価します。カラムキャパシティーは主にカラム長およびカラム径に影響されますが、溶解度やサンプル混合物の複雑さなどのその他のファクターも寄与します。カラムキャパシティーの傾向は以下のようになります：

カラムキャパシティーは主に特定のサンプルの溶解度に依存する。
単純な混合物では、カラムキャパシティーは高い。
高分離能が必要な場合、カラムキャパシティーは低くなる。
カラムキャパシティーはロードの条件に依存する。

			直径（mm）
長さ（mm）	4.6	10	19	30	50
50	3	15	45	110	310
75	?	?	?	165	?
100	5	25	90	225	620
150	8	40	135	335	930
250	13	60	225	560	1550

適切な流速（mL/分）	1.4	6.6	24	60	164
適切な注入量（µL）	20	100	350	880	2450

表 5.一般的な分取カラムサイズに対する推定負荷容量（mg）例：4.6 × 50 mm カラムの場合、予想負荷量は 20 µL 注入あたり 3 mg です。

特定の目的化合物に対するカラムキャパシティーは、分析法のスケールアップの前に負荷量試験によって決定します。負荷量試験は、小スケールで行い、サンプルを高濃度で調製し、注入量を徐々に増加させる方法、またはサンプルを複数濃度で調製し、注入量を一定に保つ方法のいずれかで実行します。どちらの手法でも、目的化合物と周辺不純物の十分な分離が維持される最大濃度または最大注入量を決定することが目標です。カラムキャパシティーが決定したら、直径の大きなカラムと大スケールのワークフローのための式を使ってスケールアップできます。

図 15.負荷量試験。星印の付いたピークに関して、負荷量が増加すると分離能が低下することに注意してください。

式 10： 濃度負荷量のスケールアップ

したがって、4.6 mm × 50 mm の分析カラムでの 1,800 µg （1.8 mg）の負荷量を 19 mm × 50 mm の分取カラムにおいて相当する負荷量にスケールアップするには：

式 11：注入量のスケールアップ

20 µL の注入量をスケールアップするには：

At-Column-Dilution

DMSO などの強溶媒によりサンプルの溶解度が改善し、カラムキャパシティーを増大させることができます。しかし、強溶媒を大量に注入するとクロマトグラフィーにひずみが発生し、分離できる化合物量が増加するどころか減少します。

ひずみは、強溶媒が水性溶媒の流れに挟まれたプラグとしてインジェクターからカラムヘッドに運ばれると発生します。サンプルの析出は、サンプル強溶媒が水性溶媒で希釈されるプラグの両端で発生します。この析出により、流路が閉塞するため、圧力超過によりシステムが停止することがあります。

図 16.カラム内での移動相によるサンプルプラグの希釈サンプルを強溶媒中に調製した場合、サンプルプラグが水系移動相を含むカラムを通って移動する際に、析出がその両端で発生する可能性があります。

析出がシステム停止を引き起こさない場合、サンプルはカラムに入りますが、サンプルプラグが移動相で希釈されるまで保持が起きません。大量注入では、このプラグをカラム内で十分な距離移動させないとサンプルを希釈するのに必要な容量が得られません。そのような場合、サンプルはカラムボリュームの大部分を占める幅の広いバンドとして堆積します。その結果、ピークが大容量の溶離液にわたって拡散し、ピークを完全に分離することができません。このような状況は、注入するサンプルの容量と質量の両方を制限することで低減することができます。

別の手段として、サンプルを水や弱溶媒で十分に希釈して十分な保持を確保する方法が挙げられます。

図 17.強溶媒中でのサンプル注入の従来のアプローチサンプルプラグは、カラムに沿って移動する際に希釈されるため、ピークのひずみが生じます。

スループットおよび回収率が低下するため、どちらのアプローチも完全に満足できるものではありません。その他の方法として、At-Column-Dilution システムでは、サンプルプラグがカラム入口まで運ばれ、そこで水系希釈液により連続的に希釈されるようにシステムを再構成する方法があります。カラムへの移動速度が非常に速いため、析出が起きません。サンプル分子はそこで、十分に分離された小容量のピークとして溶出する非常に狭いバンドとして充塡剤に吸着されます。サンプルはループやカラムヘッドではほとんど析出しないため、At-Column-Dilution によりシステムの堅牢性が改善します。

サンプル成分のピーク間の分離が改善することで、サンプル量を増やすことができ、それにより分離に必要な注入回数を少なくすることができます。実際、At-Column-Dilution では多くの場合、カラム負荷量を 3 倍から 5 倍に増やすことが可能です。高圧によるシステム停止の発生率が低下し、カラム寿命が延びます。

図 18.At-Column-Dilution システム。サンプルプラグはカラム入口まで運ばれ、そこで水系希釈液により連続的に希釈されるため、析出は起きません。サンプルバンドは十分に分離された小容量のピークとして溶出します。

図 19.従来の注入および At-Column-Dilution による注入を用いた場合の強溶媒に溶解したサンプルの比較133 mg に相当する 1,000 µL をカラムに注入しました。

流速のスケールアップ

スケールアップにおいて分離の維持を成功させるためには、小スケールと大スケールのカラムの間で線速度が必ず一定に保たれていなければなりません。そのため、流速のスケールアップには長さ、粒子径および充塡剤が同じであることが最も効果的です。流速をスケールアップする際には、最大ポンプ流速や背圧限界などシステムのハードウェア機能を考慮に入れなければなりません。ハードウェアが流速要件を満たさない場合、そのスケールに合わせるために適切な装置の変更を検討する必要があります。

式 12：流速のスケールアップ

例えば、分析カラム（5 µm、4.6 mm × 50 mm）の流速が 1.5 mL/分の場合、分取カラム（5 µm、19 mm × 50 mm）での流速は以下のように算出されます：

グラジエント時間のスケールアップ

通常、移動相の線速度を維持するために流速を調整する場合、スケールアップにおいてグラジエントの変更は不要です。しかし、カラム長が異なる場合、小スケールで得られた分離と保持時間を維持するため、グラジエント時間を計算しなければなりません。

式 13：グラジエント時間のスケールアップ

例えば、50 mm の分析カラムにおける 5 分間のリニアグラジエントセグメントは、100 mm の分取カラムでは 10 分間になります：

Prep カリキュレーター

質量、流速、およびグラジエントのスケールアップの計算は、Prep OBD カラムカリキュレーターでも行えます。このカリキュレーターは、質量負荷量、システム容量、流速、溶媒消費量、質量分析計を用いるクロマトグラフィーのスプリットフロー比、およびフォーカスグラジエント UPLC 分析法の分取法への移管など、すべての分析から分取へのスケールアップの計算に役立つ使いやすいアプリケーションです。このアプリケーションは www.waters.com/prepcalculator からアクセスするか、ChromScope などウォーターズの分取精製用ソフトウェアから使用することができます。