分取液体クロマトグラフィーの入門書

アイソクラティック分離やフォーカスグラジエントで目的の化合物を十分に分離できない場合、溶媒、pH、固定相、温度を変更して分離法を再度開発することができます。このような変更は分離に大きな影響を与えることがあるため、上記の変更のいずれかを行った場合には、スカウティンググラジエント、続いて分析法の最適化を行う必要があります。

溶媒

HPLC 移動相は、弱溶媒、強溶媒、および添加剤という 3 つの成分で構成されます。溶媒は、高純度で、検出器と適合し、サンプルとの反応性がなく、システム背圧を低く保つために粘性が低いものでなければなりません。

逆相クロマトグラフィーでは、ほとんどの場合、弱溶媒は水です。一方、アセトニトリルやメタノールは粘性が低く、高強度で、低波長範囲で UV に適合するために、強溶媒として一般的に使用されています。また、アセトニトリルとメタノールは、良好なピーク形状が得られ、分離後簡単に蒸発させることができ、ほとんどのサンプルと反応しない傾向があります。

クロマトグラフィー分離で使用されるあらゆる溶媒と同じく、サンプル分析時に報告されている溶媒 UV カットオフ波長を上回っていることが重要です。この波長を下回ると、検出器は溶媒組成の変化をベースラインドリフトまたはその他のクロマトグラフィーの乱れとして記録します。

分離で使用する強溶媒によって、分離とピーク順序が変化することがあります。目的化合物で最高の分離能を達成する溶媒を予測するのは難しいため、多くの場合、強溶媒の選択は試行錯誤で決定します。オプションとして、目的の溶出順序や分離能を達成するために複数の強溶媒を混合すること場合があります（50:50 アセトニトリル/メタノールなど）。

pH

移動相 pH は、逆相分離の保持性を制御する上で非常に重要な変数です。化合物には多くの場合、1 つまたは複数の酸性または塩基性の官能基が含まれているため、ほとんどの逆相移動相では pH の調整が必要です。

酸性化合物は、その pK_a よりも 2 pH 値単位を超えて高いまたは低い pH 条件では、99% 超がそれぞれイオン化または非イオン化します。一方、塩基性化合物は、その pK_a を下回る pH 条件ではイオン化し、その pK_a を超える pH 条件では非イオン化します。非イオン化型は極性が低く（より疎水性）、そのため逆相システムにより強く保持されます。その結果、酸性化合物は低 pH でよく保持され、塩基性化合物は高 pH でよく保持されます。

移動相の pH が目的化合物の pK_a に近い場合、pH の小さな変化が保持に大きな変化をもたらし、分離の頑健性に直接影響を与えます。移動相の pH はバッファーの添加により調整します。バッファーにより、少量の酸や塩基が添加された際に pH が維持されます。バッファーは、それぞれの pK_a の pH 単位 ±1 の範囲内で使用する場合に最も有効ですが、pK_a から pH 単位 ±2 離れていても十分な緩衝作用が得られる場合があります。

分析で使用する pH を選択する際は、カラムの安定性も考慮に入れる必要があります。

シリカベースのカラムは pH 2～8 の範囲で最適の機能を示します。結合相は、pH が低いと加水分解しやすくなり、pH が高いとシリカ骨格が溶けやすくなります。pH が 8 を超えると、シリカ以外をベースとするパーティクル、つまり高 pH での安定性のために特別に化学修飾された固定相を持つパーティクルが必要になります。pH 限界値および一般的な取り扱い上の注意はカラムの添付文書または各カラムメーカーのウェブサイトで確認してください。

クロマトグラフィー法が精製目的で使用される場合、精製後の成分からの除去を容易にするため、pH 調整に使用されるバッファー添加剤は十分な揮発性がなければなりません。また、揮発性添加物を使用する場合には、MS イオン源での汚染や析出を回避するように注意しなければなりません。ギ酸、酢酸、酢酸アンモニウムなどの一般的な添加剤は、移動相に溶解した場合、0.05 ～ 0.1% の濃度で最良の働きをします。液体クロマトグラフィー分離で最もよく使用されるバッファー添加剤であるリン酸は、精製や MS アプリケーションでは推奨されません。

バッファー濃度は 5 ～ 10 mM の範囲が推奨されます。バッファーを使用する場合は、調製後にバッファーをろ過し、使用していない時はポンプラインをフラッシュしてライン内の析出を防止し、微生物の増殖の蓄積を防止するために定期的に溶液を交換することが重要です。

固定相

カラム固定相は分離に大きな影響を与えます。逆相の固定相は C₁₈ から C₈ の範囲で、選択性と分離能を高めるために加工したリガンドを用いることがあります。多くのラボでは手持ちのカラムが限られているため、溶媒と pH では十分な分離能が得られない場合、最終手段として固定相の変更がよく行われます。ウォーターズの逆相カラム選択性チャート（www.waters.com）では、さまざまなカラム固定相製造者の間で選択性を比較できます。このツールは、分析法開発初期においてカラムの選択性を比較するのに非常に有用です。

長さ

カラム長は、分離性能における 1 つの要素です。カラムは、25 mm、50 mm、100 mm、150 mm、250 mm など、さまざまな長さのものが利用できます。

短いカラムは理論段数が少ないですが、迅速な分離に適しています。一方、長いカラムは理論段数が多く、保持時間が長くなります。カラムが長くなると、背圧、実行時間、溶媒消費量、およびコストが比例して増加するため、十分な分離能が得られる最も短いカラムが最適の選択肢です。

粒子径

サンプルが充塡剤ベッドを通過する際のサンプルバンドの拡散や広がりに抵抗するカラムの能力を「効率」と呼びます。粒子径が小さいと、粒子内でのピーク拡散が小さくなるため、効率が高くなります。高い効率は狭いピーク幅と高い分離能をもたらします。

分取カラムの粒子径は通常 5 ～ 10 µm の範囲で、超高圧の分析分離では 1.7 ～ 3.5 µm の粒子径が使用されます。非常に小さな粒子径では、高い効率が得られますが、その代償としてカラムの費用とシステム背圧が高くなります。これらの理由から、粗サンプル混合液を高流速で送液する大スケール分取カラムの場合は、非常に小さな粒子径を充塡したカラムはほとんど提供されていません。

温度

温度変化は選択性に影響するため、カラム加熱は特定サンプルの分離を最適化する場合に便利なツールです。温度が上昇すると移動相の粘性および合計システム圧が低下し、その結果、システム、フィッティング、およびカラムへの負担が軽減し、最終的に操作の頑健性が向上します。また、温度により保持時間が短縮し、分離の選択性が変化する場合があります。温度変化によりピーク分離能が向上するか低下するかを予測するのは難しいため、その有用性はそれぞれの分離ごとに異なります。

温度制御は、小スケールのクロマトグラフィーでは日常的に実施されていますが、分取スケール精製用のクロマトグラフィーを調整するパラメーターとしてはほとんど利用されていません。まず、直径の大きなカラムは、外から均一に加熱することが困難です。次に、大スケールで使用する高流速分離では、流入する移動相溶媒の温度に留まる傾向があります。電気ブランケットやカラムオーブンは、小スケールの分離には十分ですが、大きなカラムをその直径全体にわたって均一に加熱することはできません。結果として、カラムの直径方向にわたって温度勾配が発生し、クロマトグラフィーに悪影響が生じます。

サンプル溶解度を維持するために温度管理が必要な場合、カラムヘッド部に 1 本の長いチューブを接続した状態で分取カラムを加熱した恒温槽に置くことで温度勾配を克服できます。長いチューブがプレヒーターとして作用し、流入溶媒が目的の温度に平衡化します。将来のスケールアップを想定するクロマトグラフィーは、室温条件で開発するのが理想で、温度制御は最後の手段にします。