アミノ酸の加水分解および分析に関する包括的ガイド

前述のように、特別にサンプルの加水分解を支援するために、さまざまな装置が存在します。装置に関係なく、通常は、総タンパク質組成の測定に使用する酸加水分解、システインやメチオニンなどの含硫アミノ酸の測定に必要な、過ギ酸酸化に後続する酸加水分解、トリプトファンの回収率の評価に使用するアルカリ加水分解の 3 種類の加水分解プロトコルがあります。サンプル加水分解用の従来の装置では時間のかかるプロセスが含まれていますが、マイクロ波加水分解用の装置により、大幅に処理速度を向上できます。3 種類のプロトコルすべてにマイクロ波加水分解を導入することで、より高い正確さ、再現性、速度、頑健性が得られ、加水分解条件のコントロールが向上します。

マイクロ波テクノロジーを使用することにより、CEM Discover SP マイクロ波反応システム（CEM Corporation 3100 Smith Farm Road Matthews、NC 28104）（図 7）で、アミノ酸分析の準備として、タンパク質やペプチドをわずか 15 分で加水分解できます。図 8 に示されているように、マイクロ波エネルギーを直接与え、内蔵の IR 温度センサーを使用することで、各サンプルを迅速に加熱し、サンプルの設定温度を維持できます。そのまま撹拌することにより、サンプル全体の均一な熱分布が確保され、反応後の急冷によりサンプルが数秒で冷却されます。

以下のセクションで、システムのセットアップと操作について概説します。詳細については、CEM Corporation に問い合わせるか、システムマニュアルを参照してください。

• このシステムの電気的要件は、110 ～ 140 VAC、60 Hz、120 VAC で 10 A です。
• システムには換気が必要です。
• システムには最低 25 psi、最高 60 psi の圧縮空気または圧縮窒素が必要です。
• システムから 10 フィート以内にあるノートパソコン（CEM により提供）が必要です。

• 酸加水分解用 6 N 塩酸（1:1 濃塩酸：脱イオン水）。
• アルカリ加水分解用 4 N NaOH（16 g の固体 NaOH を 100 mL の脱イオン水に溶解）。
• 過ギ酸（前酸化のみ、9:1 ギ酸：30% 過酸化水素）。
• Discover SP 用 10 mL または 35 mL バイアル（撹拌子およびキャップ付き）。
• 結晶フェノール。

オプション 1

1.  50 ～ 500 mg のサンプルを撹拌子付き 35 mL バイアル中に量り取ります。
2.  消化チューブを約 15 分間、氷浴中に置きます。
3.  冷却後、5 mL の過ギ酸を加えます。
4.  ガラスストッパーでチューブを覆い、マグネチックスターラープレート上で 15 分間、低速で撹拌します。
5.  消化チューブを氷浴に戻し、16 時間酸化します。
6.  ガラスストッパーを取り外し、0.84 g のピロ亜硫酸ナトリウムを加えて過ギ酸を分解します。
7.  セクション 5.4.2「酸加水分解」のオプション 1 のステップ 2 から始まる酸加水分解を行います。

オプション 2

1.  50 ～ 500 mg のサンプルを撹拌子付き 35 mL バイアル中に量り取ります。
2.  新しく調製した過ギ酸溶液（9:1 ギ酸：30% 過酸化水素）6 mL を加えます。
3.  反応混合液を 50 ℃ で 1 時間、水浴中でインキュベーションします。
4.  50 ℃ の蒸発器内で残留過ギ酸溶液を蒸発乾固します。
5.  セクション 5.4.2 酸加水分解のオプション 1 のステップ 2 から始まる酸加水分解を行います。

オプション 1：50 ～ 300 mg サンプル

1.  サンプルを撹拌子付きの 35 mL バイアル中に量り取ります。
2.  3% フェノール（重量比）を加えます。
3.  6 N 塩酸を 5 mL 加えます。
4.  バイアルにキャップを取り付けます。
5.  Dynamic Method Control を使用して、メソッドを 300 W、15 分間保持、195 ℃、300 psi でプログラムします。撹拌は高に設定する必要があります。
6.  バイアルを Discover の穴部分に入れ、スタートキーを押してメソッドを開始します。
7.  サンプルは、250 psi （±10%）以下で 195 ℃ まで加熱します。

オプション 2：300 ～ 500 mg サンプル

1.  サンプルを撹拌子付きの 35 mL バイアル中に量り取ります。
2.  3% フェノール（重量比）を加えます。
3.  6 N 塩酸を 10 mL 加えます。
4.  バイアルにキャップを取り付けます。
5.  Dynamic Method Control を使用して、メソッドを 300 W、15 分間保持、195 ℃、300 psi でプログラムします。撹拌は高に設定する必要があります。
6.  バイアルを Discover の穴部分に入れ、スタートキーを押してメソッドを開始します。
7.  サンプルは、250 psi （±10%）以下で 195 ℃ まで加熱します。

オプション 1：50 ～ 300 mg サンプル

1.  サンプルを撹拌子付きの 35 mL バイアル中に量り取ります。
2.  4 N NaOH を 5 mL 加えます。
3.  バイアルにキャップを取り付けます。
4.  Dynamic Method Control を使用して、メソッドを 300 W、15 分間保持、195 ℃、300 psi でプログラムします。撹拌は高に設定する必要があります。
5.  バイアルを Discover の穴部分に入れ、スタートキーを押してメソッドを開始します。
6.  サンプルは、250 psi （±10%）以下で 195 ℃ まで加熱します。

オプション 2：300 ～ 500 mg サンプル

1.  サンプルを撹拌子付きの 35 mL バイアル中に量り取ります。
2.  4 N NaOH を 10 mL 加えます。
3.  バイアルにキャップを取り付けます。
4.  Dynamic Method Control を使用して、メソッドを 300 W、15 分間保持、195 ℃、300 psi でプログラムします。撹拌は高に設定する必要があります。
5.  バイアルを Discover の穴部分に入れ、スタートキーを押してメソッドを開始します。
6.  サンプルは、250 psi （±10%）以下で 195 ℃ まで加熱します。

温度、時間、電力の設定は、加水分解するサンプルの種類によって異なります。マイクロ波が手順全体を通して機能するように維持することが重要です。これには、ユーザーによる若干の実験により、この手法を使用するサンプルを最適化する必要がある場合があります。

前述の手順で、適切なサンプルサイズ、ボリューム、容器を使用することを推奨します。これらのファクターは加水分解を成功させるために不可欠です。サンプルの一部の成分は加水分解後も固相のままであり、図 9 に示すように、通常処理中に黒色になります。この現象は正常であり、アミノ酸は溶液中に存在します。CEM 装置の使用に関するご質問はすべて、molecular.support@cem.com にメールを送るか、または 1-704-821-7015 に電話して、CEM 分子サンプル前処理チームにお問い合わせください。