胺基酸水解與分析綜合指南

以液相層析和光學偵測分析胺基酸需要額外進行樣品前處理，因為多數胺基酸沒有發色團，無法偵測。因此，胺基酸分析在水解後的下一步就是衍生化。本節說明如何使用Waters AccQ•Tag化學品進行蛋白質或胜肽水解物的衍生化前處理。

為正確可靠地執行水解後樣品的衍生化，必須考量以下幾點：

• 去除顆粒
• 確定需衍生化的樣品質量
• 確定是否有必要中和樣品
• 根據樣品質量使用過量衍生化試劑

以下出於必要只摘列簡要內容。如需詳細的AccQ•Tag衍生化化學品資訊和指引，請上網瀏覽www.waters.com/AAA。

如有大量顆粒或漂浮脂質，可能必須進行離心處理。離心處理後，要抽取等分澄清水解物進行衍生化就更容易了。

若是飼料分析水解物之類的大體積樣品，只要過濾顆粒或許就夠了，但請注意，您所選的過濾材料可能會影響樣品回收率。為得到客觀公正的結果，必須考量並解決這項因素。請向濾器製造商洽詢詳細資料，瞭解濾器在此應用中的效能。

AccQ•Tag方法是一種管柱前衍生化技術，適用於水解後胜肽與蛋白質的胺基酸分析。AccQ•Tag方法能發揮下列作用：

• 使用Waters AccQ•Tag Ultra或AccQ•Fluor試劑將胺基酸衍生化
• 使用基於梯度的逆相HPLC或UPLC分離衍生物
• 使用外部胺基酸標準品和光學偵測技術準確定量衍生物

6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC)試劑會與一級胺和二級胺產生反應。過量AQC試劑會與水產生反應，形成6-氨基喹啉(AMQ)。AMQ會慢慢與過量AQC試劑產生反應，形成雙尿素。這些副產品並不會對胜肽或蛋白質水解物所含胺基酸的分離、鑑定以及定量造成干擾。衍生物在數天內都能保持穩定，因此如若需要，可以分批處理或反覆分析。

多年來，我們進行了大量研究，希望能夠確保AccQ•Tag衍生化反應的準確性。這個化學反應本身需要過量莫耳量的衍生化試劑和鹼性pH (8–10)，才能使所有胺基酸完全衍生化。目前已開發出多種能夠解決這些重要因素的策略。

這項反應通常需將樣品稀釋成10倍，並從100 µL總衍生化體積中抽取1 µL注入管柱。由於所有胺基酸在衍生化過程中的量未必相同，因此樣品量至少要足以讓最少量的胺基酸也能達到偵測極限或定量極限。建議以最大注射量1 µL衍生化至少1 pmol的最少量胺基酸，這樣能夠得到準確的定量結果。要確定所需樣品量，請進行以下計算：

計算範例：
對於蛋白質濃度為1.0 mg/mL的樣品：
估算最少量胺基酸所需的樣品量。在這個範例中，我們假設需要0.03 mg/mL才能讓這種胺基酸達到1 pmol的管柱載量。

將mg換算成莫耳量（蛋白質中胺基酸殘基的平均分子量是110）。

這是這個樣品中最少量胺基酸的濃度估算值。

結果是稀釋27倍(10 ÷ 0.37 = 27)。

水解物在衍生化之前必須稀釋27倍。例如：5 µL樣品水解物以135 µL的0.1 N HCl稀釋即可達到這個目標值。

最後，可以取上述稀釋液的一等分(10 µL)轉移到衍生化樣品瓶中。

為確保AccQ•Tag試劑完全衍生化水解物所含的胺基酸，必須以大約8.2-10.1的pH範圍緩衝樣品。若未妥善中和酸水解物，pH值低於8.2，就不能完全衍生化。pH對每一種胺基酸的影響各異。請注意，所有胺基酸受到的影響並非相等。酸性胺基酸（如麩胺酸和丙胺酸）受到的影響比絲胺酸或苯丙胺酸大。pH是準確定量原始樣品中所有胺基酸的重要因素。

• 若用0.1 N HCl製備胺基酸溶液，就可以將10–20 µL樣品直接移入衍生混合物中，不需要調節pH。註：仍然需要確保有過量的衍生化試劑，如下所述。
• 若胺基酸溶液的酸濃度較高(>0.1 N HCl)，應以濃度相同的等量氫氧化鈉進行中和。處理方式可以是以總體積添加，也可以併入衍生化步驟。
  • 將所需量的硼酸鹽緩衝液替換成NaOH，中和樣品中的HCl。
  • 在衍生化反應瓶混合物中，放入10 µL的xM NaOH和60 µL硼酸鹽。添加10 µL的AA樣品（溶於xN HCl中）。使用20 µL的AccQ•Fluor試劑進行衍生化。
• 如對適當中和有任何疑問，您可以製備試驗樣品並使用一次性pH試紙檢查最終pH。

警告：添加衍生化試劑後，若樣品變成亮黃色，表示樣品的pH值太低。請以NaOH中和。

計算範例：
要確定中和所需的NaOH量，請進行以下計算。
對於上述用6 N HCl製備的含1.0 mg/mL蛋白質的樣品，需稀釋27倍才能確保樣品中有過量的衍生化試劑，因此可以使用下列計算方式。

將樣品的酸濃度從莫耳換算成µmol：

確定稀釋樣品中的最終酸濃度：

提醒：5 µL樣品水解物以135 µL的0.1 N HCl稀釋即可達到這個目標值。

每次衍生化需要的NaOH總量是0.31 M。

衍生化過程添加的硼酸鹽總量是70 µL，因此有兩種中和方法：

每次衍生化添加10 µL的0.31 M NaOH和60 µL緩衝液。

另取一個樣品瓶，混合600 µL硼酸鹽緩衝液與100 µL的0.31 M NaOH。混合。每份樣品添加70 µL混合物 + 10 µL樣品 + 20 µL AccQ•Tag衍生化試劑。

要使所有胺基酸完全衍生化，反應過程需要莫耳量過量4–6倍的AccQ•Tag衍生化試劑。若試劑不足，某些相對靈敏的胺基酸就無法完全衍生化。每種胺基酸的衍生化比率因胺基酸的化學性質而異；例如，AccQ•Tag莫耳量過量不足時，丙胺酸的回收率可能會大受影響，而苯丙胺酸就比較不容易受影響。

要確定應添加至試劑瓶中的樣品量，我們需要知道每個試劑瓶中的試劑量。標準AccQ•Tag試劑瓶含3–4 mg試劑，大約是10–14 µmol試劑。由於試劑溶於1 mL乙腈中，且每100 µL衍生化反應要用到20 µL試劑，因此每個反應瓶各含210–280nmol衍生化試劑。

由於每個反應瓶各含210–280 nmol試劑，且每個樣品需有4–6倍莫耳量過量，因此每次反應的胺總量不應少於40–140 nmol。

計算範例：
對於蛋白質樣品，請使用樣品重量和胺基酸的平均重量估算所需的過量。

例如，若蛋白質濃度是1 mg/mL，平均分子量是110，可以按照下列計算方式確定樣品中的蛋白質量：

其中MW的單位會從g/mol換算成µg/µmol，且

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

確定莫耳濃度後，就能計算出樣品中的胺基酸含量。

使用第6.3.1節步驟1中的1 mg/mL蛋白質（需要稀釋27倍，5 µL水解物原液 + 135 µL緩衝液），按照以下方式計算出10 µL稀釋樣品的nmol：

3.3 nmol遠低於極限140 nmol，因此樣品在可以接受的範圍內。

Waters Corporation於1992年在市面上推出HPLC AccQ•Tag方法，這項方法與2006年推出的AccQ•Tag Ultra方法採用相同的管柱前衍生化步驟。AccQ•Fluor試劑6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC)能夠透過一個簡單的單步驟反應衍生化一級胺與二級胺，從而產出穩定度相當高的螢光加成物。我們提供的AccQ•Tag方法是一個系統套裝，內含現成的試劑套裝以及相當豐富的說明文件。AccQ•Tag化學品套裝所含物品可供250次蛋白質與胜肽水解胺基酸分析使用。

AccQ•Tag衍生化套組含五組衍生化試劑。每一組試劑各含一個下列樣品瓶：

• AccQ•Fluor硼酸鹽緩衝液 – 添加於樣品中，確保達到衍生化所需的最佳pH值。
• AccQ•Fluor試劑粉 – 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC)衍生化試劑（乾燥出貨以利保持最大的穩定性）。
• AccQ•Fluor試劑稀釋劑 – 乙腈，用於回溶衍生化需要的試劑。

Waters UPLC胺基酸分析解決方案是經過全面設計的統包式胺基酸分析解決方案。在Waters ACQUITY UPLC系統上使用內附的AccQ•Tag Ultra、逆相UPLC管柱、沖提液和方法解析管柱前衍生胺基酸。耐用的衍生化化學品、穩定的層析分離基線，以及一流的胺基酸解析度，有助於保證定量結果的準確度、精密度以及一致性。

UPLC胺基酸分析解決方案含：

• Waters AccQ•Tag Ultra化學品備件，包括管柱、試劑和沖提液，全數通過胺基酸分析應用的品管檢驗。
• Empower 2軟體、預先設定的專案、方法以及報告格式
• 完整系統與應用程式級支援說明文件

Waters ACQUITY UPLC系統支援三種不同的光學偵測器：可調式UV、PDA以及螢光偵測器。

UPLC胺基酸分析解決方案含兩種完整的方法，兩者均使用相同的儀器和化學品。第一種方法適合由蛋白質水解爾來的胺基酸。第二種方法適合細胞培養基或發酵液等製程樣品中存在的大量游離胺基酸。兩種方法的不同之處在於AccQ•Tag Ultra沖提液A的稀釋度與分離管柱的溫度。不論使用沖提液A或沖提液B，使用者均無法調整pH或修改成分。

蛋白質的胺基酸分析是結構測定的一部分，也是量測樣品所含蛋白質總量的方法。樣品在分析前需水解。若進行結構分析，會比較觀察所得的胺基酸莫耳比與序列預期值。

若是測定蛋白質量，會加總胺基酸的重量。這種蛋白質濃度量測方式用於計算樣品成分干擾一般蛋白質分析的消光係數。每種胺基酸的重量百分比與蛋白質總質量皆用於評估食品與飼料的營養成分。Waters UPLC胺基酸分析解決方案能在這些應用中提供穩固的例行分析。