胺基酸水解與分析綜合指南

雖然本指南整體是專注於胺基酸分析的初始步驟—強調水解的樣品前處理—本節簡單介紹胺基酸分析中較為常用的定量方法。下列範例的胺基酸分析已經取得結果；需要計算原始的樣品濃度。這些樣品假設已經使用AccQ•Tag 或 AccQ•Fluor試劑進行衍生化。

在進行定量之前：

• 確認所有層析峰均已正確鑑定。
• 如果滯留時間不相符，請檢查校正表中的值。
• 檢查所有層析峰的正確積分。

某些分析的目標只是確定分析樣品的濃度。這些結果通常以莫耳濃度表示，例如µmol/L。層析分離結果一般以皮莫耳表示。以層析分離軟體報告的胺基酸皮莫耳值除以注射量即可計算出濃度，再以此值乘以稀釋劑體積與衍生化體積的比值。乘以稀釋係數，再將單位轉換成µmol/L，即可完成計算。

計算範例：
根據報告值確定原始樣品中的胺基酸濃度時，使用以下方程式：

其中：

pmol AA = 樣品中報告的胺基酸量

Vi = 注射量(µL)，通常是1 µL

Vd = 衍生化體積(µL)，通常是10 µL

Vr = 回溶樣品所用的稀釋劑體積(µL)

Dil.Factor = 稀釋係數

範例：

初始的100 µL水解蛋白質樣品用內標準品以1:1稀釋。取10 µL等分試樣衍生化。天門冬醯胺(Asn)的注射量是1 µL，報告值是312.5皮莫耳。

Asn濃度(µmol/L)為：

確定水解蛋白質的胺基酸組成需要計算樣品各成分的莫耳比。

每種純蛋白質所含各胺基酸都有特定的殘基化學計量數。理想情形下，分析出的莫耳比結果應為整數。觀測值趨向理想值的程度與蛋白質或胜肽的純度、水解條件的充分性以及胺基酸分析的品質有關。

範例1（見下表）：

1. 將每種胺基酸的觀測皮莫耳值（從分析中取得）製成表格。
2. 透過檢查估計每種胺基酸的殘基數預估組成。註：觀察到的殘基是每種胺基酸的相對莫耳濃度。將所有觀測皮莫耳值除以最少量胺基酸並四捨五入到最近位數。
3. 加總所有胺基酸殘基的皮莫耳值與數量。
4. 以觀測皮莫耳值總和除以預估組成總和，計算平均皮莫耳/殘基。
5. 以每個觀測皮莫耳值除以皮莫耳/殘基值計算出觀測組成。

警告：對於較大的蛋白質，估計殘基數比較困難，因為要求更高的精密度。

警告：有些胺基酸的水解回收率可能各異（絲氨酸、Tor、酪胺酸與甲硫胺酸都會降解；纈氨酸與異白胺酸鍵可能難以裂解）。

註：若要改善這些情況的定量分析，建議執行一段時間的研究。一般而言，樣品需水解24、48與72（或96）小時；不穩定的氨基酸值透過反推到零時確定，而異白胺酸與纈氨酸的值是從最長的水解所取得的。

範例2：
在有些情況下，如前所述，計算莫耳百分比（蛋白質每100個殘基中每種胺基酸的殘基數）的結果可能較為理想。計算方式如下：

如果可以估計蛋白質分子量，有兩種用於計算近似組成的方法：

1. 估計樣品分子量(MW)。
2. 加總胺基酸的總產出量（皮莫耳）。
3. 以分子量除以110（胺基酸的平均MW）。註：這種方法可充分計算總鏈長或總氨基酸的近似值。
4. 以總產出量除以鏈長（等於注射樣品的莫耳量）。
5. 以每種胺基酸的量除以注射的莫耳量（等於每莫耳的殘基數）。檢驗相較於整數值的誤差。
6. 略高於或低於除數（注射的莫耳量），將相較於整數值（在步驟5取得）的誤差降至最低。此步驟可以利用找出最小誤差的電腦試算表程式或訂製的胺基酸軟體簡化。
7. 切記不穩定胺基酸與穩定鍵形成劑的值可能因為水解回收率差而大幅偏離整數值。

此替代程序需要更多樣品相關知識。

1. 選擇符合以下兩項標準的胺基酸進行分析：
   • 水解與衍生化有良好的產出量（例如Asp、Glu、His、Arg、Ala、Pro、Leu、Phe、Lys）。避免選擇Gly，因為它是常見的背景污染物；
   • 每莫耳樣品僅有少量殘基（根據估計的樣品分子量與胺基酸產出量）。該資訊可以從其他程序取得，例如溴化氰分解，可以選擇性地裂解甲硫胺酸的完整多肽鏈。
2. 根據此資訊選擇此胺基酸的整數值。
3. 以選定胺基酸的產出量除以選定的整數值即可計算出注射樣品的估計莫耳量。
4. 依照第7.3.2.1節的步驟5與6。
5. 檢查值（一個大於選定的整數值，一個小於選定的整數值）與整數的偏差是否減小。

計算每種胺基酸的皮莫耳數乘以各自分子量的乘積總和，就能得到原始樣品中胜肽或蛋白質的濃度。

使用第7.3.1節的表格所引範例開始如下計算：

計算範例：

樣品中的Asp（天門冬氨酸）：觀測皮莫耳值220，胺基酸分子量133.10 g/mole，計算結果如下：

此方法適用於每種需要計算的胺基酸。下表顯示每種胺基酸的皮克計算值，右下角是注射樣品的蛋白質皮克值總和。

食品與飼料分析也適用上述計算值。不過，大部分飼料分析更看重的資訊是，有生長限制作用的特定胺基酸的含量，例如甲硫胺酸與半胱胺酸。最受關注的值是樣品中的胺基酸重量%。

計算胺基酸重量%：

計算範例：

報告的含量值(pmol/µL)必須乘以殘基MW(gm/mol)與任何的換算係數。

然後將報告的含量(g/mol)再乘以任何稀釋係數。之後將結果除以樣品重量，再乘以100以換算成百分比。

計算範例：

其中：

    Amount = 胺基酸含量(g/mL)

    Dilution = 樣品稀釋係數

樣品重量 = 重量(mg)

此方法需要使用內標準品。

計算範例：

內標準品的層析峰面積乘以胺基酸重量(mg)。然後再除以胺基酸的層析峰面積乘以內標準品重量的值。

其中：

    RF_aa = 胺基酸的感應因子

    P_n = 內標準品的層析峰面積

    P_aa = 樣品中胺基酸的層析峰面積

    W_aa = 胺基酸的重量(mg)

    W_n = 內標準品的重量(mg)

含量%計算從胺基酸的層析峰面積乘以所計算的感應因子開始。然後再乘以內標準品係數。此數值再除以內標準品的層析峰面積與所分析之樣品重量的乘積。再換算成百分比。

其中：

    P_aa = 胺基酸的層析峰面積

    P_n = 內標準品的層析峰面積

    RF_aa = 所計算的感應因子

    IS = 計算的內標準品係數

範例：

對於飼料樣品中的胺基酸，確定以下值：

    胺基酸重量(W_aa) = 0.5 mg

    胺基酸的層析峰面積(P_aa) = 100,000

    內標準品的層析峰面積(P_n) = 110,000

    內標準品的重量(W_n) = 0.5 mg

    測試部份的重量(W_s) = 10 mg

0.5 mg x 2 x 10-2 = 0.05

所關注的胺基酸在飼料中的重量是0.9%。