胺基酸水解與分析綜合指南

「蛋白質和胜肽」一詞是指生物反應器或純化製備製程中產生的相對純的樣品。這些樣品幾乎不含其他非蛋白質物質。從完整蛋白質或胜肽中產生游離胺基酸是胺基酸分析中產生實用、準確數據的關鍵步驟。為順利產生這樣的數據，一定要將蛋白質/胜肽分解或水解成單個胺基酸成分。

本節介紹汽相和液相蛋白質與胜肽水解的基本程序，重點強調讓分析過程發揮最佳效用不可或缺的作業前注意事項。

其他各小節說明特殊樣品分析適用的其他水解程序，這類樣品包含不適合使用標準酸(HCI)水解技術的胺基酸：色胺酸和半胱胺酸/胱胺酸。

本節重點探討以HCI進行的酸水解，這是製備胺基酸樣品最普遍的方法。不過，為讓蛋白質樣品能徹底水解（不分任何方法），必須考量幾項因素。評估程序時應考量中和緩衝液以及任何存在的固體。此外，蛋白質所含胺基酸的水解速度或程度不盡相同，因此有必要考量水解過程需要的時間，並且適度確認整體方法的效力。水解過程中處理樣品的方式正確無誤，才能分析出優質的結果。這類分析最容易發生的困難，通常源自於技術不當或不夠仔細。要使用這種方法發揮蛋白質水解成效，首先必須回答四個問題：

1. 有必要稀釋樣品嗎？
2. 應在水解試管中滴入多少樣品量？
3. 向水解試管中加入酸時，具體的量應該是多少（只限於液相水解）？
4. 在這個階段如使用內標準品，使用量應該是多少？

下列各節概述必要的測定方式，如果可行，也會提供計算範例。

2.1.1 作業前注意事項

除非樣品有限，否則水解過程應有2~25 µg的蛋白質，才能最大限度減少污染的影響。不分水解模式，建議量一律是20 µg。

• 樣品中不應有過剩的固體材料。這類材料有可能會干擾汽相水解作用。
• 蛋白質樣品中若含其他固體，應按每體積酸的固體濃度將固體重量併入蛋白質重量計算。
• 水解過程中，酸的淨濃度應約為6 N。
• 優先建議使用內標準品（例如Nva [正纈氨酸]），外標準品次之。
• 應在水解之前添加內標準品。如適用，可以在樣品前處理過程中添加內標準品，也可以先將內標準品加入酸中，再將酸添加於水解試管內。計算內標準品用量時，通常以校準所用標準品的量為準。
• 向水解所用的酸中添加苯酚，發揮脫氧劑的作用。

2.1.2 進行液相水解前稀釋樣品（視必要與否）

• 向水解試管中加入至少10 µL樣品（稀釋或未稀釋皆可）。量若不足，會因為體積不確定而導致不能接受的誤差量。
• 水解時也需要過量酸，應是樣品重量的10–100倍。若使用濃度太高的樣品，可能無法發揮水解成效。在這些情況下就必須稀釋樣品。進行液相水解時一定要有過量酸，約為樣品重量的100倍。
• 酸的莫耳量一定要比樣品中的緩衝液多25倍。將磷酸鹽緩衝液的莫耳量乘以3，用於說明三個可滴定基。
• 水解總體積不應超過水解試管或水解瓶總容量的50%。若使用6 x 50 mm試管，建議最大體積是100 µL。最終總體積要包含酸的體積和內標準品的體積。

計算範例：確定是否需要稀釋

以150 mM氯化鈉中的5 mg/mL蛋白質為例，確定固體（含鹽）的量和稀釋係數。

第一步是確定樣品中的固體總量。將蛋白質濃度(µg/µL)乘以鹽的重量濃度（濃度 x MW）就能計算出固體總量。

下一步是以20 µg蛋白質（溶於20 µL溶液）為目標，確定需要的稀釋比。將所需的量/體積乘以樣品的濃度倒數即可計算出來。按照計算結果，前述樣品需要的稀釋比是1:5。

2.1.3 應放入水解試管中的樣品體積

建議的水解總體積是100 µL（使用6 x 50試管），樣品體積範圍介於10–20 µL。無論稀釋與否，這個樣品體積一律取決於所進行的水解類型，並且遵循以下準則：

• 汽相水解：以真空乾燥方式將樣品處理成水解試管底部的薄膜。
• 液相水解：以至少水解2 µg蛋白質為準，將適量樣品放入水解試管中；或者從更大量的樣品（蛋白質不超過25 µg）中，以轉移約0.2 µg蛋白質（最好溶於10 µL溶液）進行水解為準，用足量的0.1 N HCl回溶樣品。

請務必注意，樣品等分試樣中的蛋白質含量越少，分析遭到污染的風險越高。

2.1.4 水解過程應添加的酸體積

水解過程中添加的酸體積非常重要，液相水解尤其如此。以下詳細舉例說明酸體積準則。

• 汽相水解：
  • 將200 µL含0.1–0.5%苯酚的6 N HCl添加於水解瓶底部。（如使用市售水解工作站，請按照廠商建議的體積添加。如需詳細資訊，請參閱第4節和第5節。）
• 液相水解（請見下方範例）：
  • 確保最終酸濃度是6 N（添加苯酚後）。
  • 確保酸的莫耳量足夠（過量約25倍），可以中和緩衝液。
  • 確保有足夠過量的酸超過固體總量（過量約100倍）。這個估算值除了蛋白質以外，還要納入樣品基質和其他固體。

計算範例：確定液相水解需添加的酸體積

按照前述準則，水解過程應添加的酸至少必須超過緩衝液濃度的25倍，重量必須超過樣品重量的100倍。因此，要確定所需的酸體積，您必須計算下列結果：

1. 緩衝液量
2. 中和樣品緩衝液（25倍）所需的酸量
3. 將酸量換算成體積
4. 樣品中的固體總量
5. 達成酸重量超過樣品重量（100倍）這一目標至少要添加的酸量
6. 將酸量換算成體積
7. 需要添加的酸總量（中和及過量加總）

以2.1 mg/mL蛋白質溶於2 mM Na/K₂PO₄為例：

要確定每支試管中的緩衝液量，可以用緩衝液莫耳濃度乘以可滴定基數量（磷酸鹽緩衝液是3），然後按照加入的樣品總體積（這個範例是10 µL）進行調整。

每支試管會有60 nmol緩衝液。

接下來，將上一步得到的緩衝液量乘以25就能計算出25倍過量值。

這個數字就是要達到充分中和所需緩衝酸的莫耳量。

接下來必須將中和所需緩衝液的莫耳量換算成每支試管中應添加的酸體積。

以這個樣品來說，0.25 µL的體積就能充分中和緩衝液。

要讓樣品中的酸過量100倍，就必須確定樣品所含的固體總量。固體總量是蛋白質加緩衝液再加上任何其他存在的物質。此範例的樣品是純化蛋白質。

將蛋白質濃度(µg/µL)乘以鹽的重量濃度（濃度 x MW）就能計算出固體總量。

計算結果得出，這個樣品的固體總量是24.9 µg。

將固體總量乘以100就能計算出100倍過量酸的目標值。

最後將過量重量換算成添加至每支試管中的6 M HCl體積，換算公式是將重量乘以酸的每莫耳重量再乘以酸的體積莫耳濃度。

在這個範例中，11.4 µL的6 M HCl就能提供100倍於樣品的過量酸。

每支試管中應添加的最終酸體積是中和樣品緩衝液所需體積與提供100倍過量酸所需體積的總和：

需要體積11.65 µL的6 M HCl才能充分水解蛋白質。這個體積可以四捨五入成能準確轉移的體積。

2.1.5 內標準品(IS)

使用內標準品(IS)能對樣品中單個胺基酸的可變水解發揮最好的補償作用。正纈氨酸(Nva)是普遍使用的內標準品。

使用內標準品時：

• 可以在樣品中製備並和樣品一起放入。
• 可以和樣品分開添加。
• 可以在酸中製備並和酸一起放入。
• 製備內標準品時，儀器上1 µL注射量提供的管柱上樣量一定要和樣品一樣。

計算公式會從樣品需要的IS量反推起始樣品所需的IS量。計算過程中請務必考量衍生化步驟。

計算範例：確定樣品的內標準品量

IS總量是透過反推確定的，方式是將最終樣品所需的IS量乘以水解試管中衍生化以及回溶樣品的稀釋係數。在這個範例中，最終衍生化樣品所需的IS為25 pmol，而樣品在衍生化過程中會稀釋10倍，衍生化之前的樣品會稀釋5倍。因此：

這表示水解樣品需要1250 pmol IS。

有了MW (mg/mol)並將µL換算成mL之後，可以知道我們需在每mL起始樣品中添加0.14 mg IS。

2.1.6 汽相酸水解

對於相對純淨且幾乎不含顆粒物質的蛋白質或胜肽樣品，建議採用汽相水解。這是靈敏度最高的方法。進行這類水解時，最好使用獨立式的自動水解工作站。程序中所需的真空控制、溫度保持、氮氣沖洗以及樣品乾燥等步驟，最好能以自動系統進行，例如第4節所述的Eldex水解工作站。

試劑：

• 6 N HCl，含1%苯酚（按體積計算）
• 氮氣（預純化級）
• 乾冰

註：如需詳細的試劑資訊，請參閱水解工作站的操作手冊。

程序（以使用自動工作站為準）：

1. 在6 x 50 mm水解試管中乾燥一份含0.5–20 µg蛋白質的等分試樣。
2. 將200 µL含0.5%苯酚的常沸HCL添加至真空瓶的底部（見下方提示）。
3. 交替完成三次抽真空-氮氣沖洗步驟後，在真空狀態下密封真空瓶。
4. 在112–116 °C下水解24小時。
5. 待真空瓶冷卻；以實驗室紙巾擦掉試管外側多餘的HCI；在真空狀態下乾燥。

提示：

• 使用結晶酚，並將一塊結晶（約0.5 mg）放在真空瓶底部。結晶比液態酚更乾淨，也更穩定。
• 小心地將樣品和內標準品移入試管底部；使用注射筒移液更為準確且容易。
• 您可以用銼刀或尖頭鉛筆在試管上劃線做記號。
• 避免HCl液滴流入管內。將試管筆直放入真空瓶中。若試管數量不足10–12支，可以加入空試管支撐。冷卻時讓真空瓶保持微傾會比較好。

註：水解後，HCl溶液通常會變成棕色。這是由苯酚而來。使用乙醇或丙酮即可充分消除真空瓶和上部的變色部分。

小心：要區分水解造成的問題與衍生化造成的問題未必容易。

2.1.7 液相酸水解

樣品較複雜時適合使用液相水解。在這類樣品中，顆粒或其他異物可能會干擾汽相過程。整體而言，這種方法靈敏度較低；不過，執行過程中只要仔細並精準，就能得到很好的結果。

• 這種方法需要的儀器和試劑：
• 分析天平
• 能保持設定溫度±0.1 °C的烘箱或加熱塊
• 試管震盪器
• 定量移液管
• 可調式微量移液管
• 附蓋水解試管，建議尺寸6 x 50 mm
• 沖洗氮氣源
• 6 N HCl

程序：

開始之前 –

稱取相當於約20 mg蛋白質的樣品（精確到0.1 mg）放入水解試管中，或將稀釋過的樣品移入試管中（按照第2.1.3節和第2.1.4節的計算方式計算）。正常情況下的總體積是10 µL。混合。

1. 按照第2.1.5節的計算方式算出內標準品的正確體積，精確添加於水解試管中。混合。
2. 加入過量6 N HCI（按照第2.1.4節步驟3計算），混合後以氮氣吹掃30秒。立即蓋上蓋子。
3. 在110 °C烘箱放置24小時。（這些參數應是研究相關蛋白質和胺基酸一段時間後得到的結果）。
4. 自烘箱中取出放涼。
5. 樣品製備完成，可以進入衍生化步驟。

2.1.8 酸水解疑難排解

有幾種胺基酸會因為水解方式不當而受到影響。例如：

• 若甲硫胺酸(Met)和酪胺酸(Tyr)產出量不高，通常表示水解程序不當—HCl不純或脫氧不當。兩種情況都有可能形成氯，後續造成Tyr氯化。
• 水解胺基酸（異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、纈氨酸(Val)和其他胺基酸）的產出量若不高，可能表示水解不完全，原因有：烘箱溫度過低、水解時間太短（尤其是採用快速高溫水解時），或者氮氣吹掃排出過多HCI導致HCI不足（可能只有特定樣品會出現這個問題；有些序列對水解的耐受性特別強，例如lle-Val-Leu）。將樣品瓶放入烘箱前，先確認瓶內仍然能看見液相HCl。HCl過多也有可能造成問題；樣品中的液體可能會冷凝，導致出現棕色殘留物、Tyr和Met流失，以及出現雜散峰。
• 若不使用氣相水解工作站，請務必確認水解設定正確無誤。整個水解瓶必須完全在烘箱內；若使用只包覆水解瓶下半部的加熱塊，液相HCl會在上部冷凝，水解將無法發揮成效。 

由於蛋白質和胜肽中的色胺酸在使用6 N HCl的標準水解條件下不穩定，因此難以分析這種胺基酸。可以選擇其他水解程序產生適合分析的完整Trp：

• 磺酸水解（例如甲磺酸和對甲苯磺酸）
• 鹼水解以及在HCI中使用硫醇試劑，例如β-巰基乙醇(BME)或巰基乙酸

2.2.1 用於色胺酸分析的甲磺酸(MSA)水解

酸不易揮發，因此必須將MSA試劑直接添加於6 x 50 mm樣品試管中（液相水解）。水解後添加甲醇和進行中和，能夠對色胺酸呈現很好的結果，且不會干擾後續的任何衍生化過程。圖2說明MSA與蛋白質的反應。

註：這項程序也能用於測定Cys和Met。Cys會被轉換成Cya，Met會被轉換成甲硫胺酸碸。

註：Tyr和Trp在過氧甲酸氧化程序中不穩定，這是Cys和Met分析常用的程序。

2.2.1.1 儀器和試劑

• 含0.2% (w/v)鹽酸色胺的4 M MSA
• 超純水
• 甲醇-水-三乙胺，比例是2:2:1
• 水解試管，6 x 50 mm
• 真空乾燥儀器
• 水浴或加熱塊

2.2.1.2 程序

1. 向每支裝有乾燥樣品的6 x 50 mm樣品試管中加入20 µL含0.2% (w/v)鹽酸色胺的4 M MSA。
2. 向反應瓶中加入100 µL水。
3. 密封以備水解。
4. 在110 °C下水解20–24小時。
5. 冷卻後打開樣品瓶，再向每支樣品試管中加入22 µL的4 M KOH（足夠用於中和）。
6. 在真空狀態下乾燥。
7. 樣品製備完成，可以進行衍生化。

提示：

使用空白對照樣品檢查是否存在干擾。

• 使用新鮮的純MSA。
• 市售酸中當成添加劑使用的色胺偶爾會造成干擾，使Tyr或Val模糊難辨。使用不含添加劑的MSA可以解決問題。
• 使用新鮮的KOH（如果實驗室中的NaOH比較乾淨，也可以用NaOH替代）。使用試驗樣品測試鹼中和酸的能力。加入適量鹼，讓鹼過量保持在最低限度。
• 用H2O製備2.5 µmol/mL的Trp標準品。存放在冰箱中。按1:1的比例混合Trp標準品和H標準品，用於校準。

注意：

• 可能會發生干擾Tyr和Val的情形，原因不明。（建議使用HCl水解Tyr）。
• Met產出量不高與水解條件有關。
• Trp和Met的產出量不呈線性，原因在水解過程而非分析程序。水解量減少，產出量自然會下降；Met的結果更顯著。
• Arg結果的再現性不佳—原因不明。

2.2.2 色胺酸分析的鹼水解

若色胺酸的酸水解出現穩定性問題，可以另外選擇使用鹼水解蛋白質。

• NaOH
• 乙酸
• 超純水
• 水解試管，6 x 50 mm
• 真空乾燥儀器
• 水浴或加熱塊

1. 為防止形成矽酸鹽，也避免後續發生溶解或衍生化問題，可能需要使用塑膠（如鐵氟龍）試管。
2. 按照上述MSA程序，將20 µL新鮮的4 M NaOH直接加入水解試管中。
3. 密封試管，在112 °C下加熱16小時。
4. 冷卻後以過量乙酸中和。
5. 樣品製備完成，可以進行衍生化。
6. 分析空白樣，確定污染程度。
7. 使用標準品和已知樣品進行方法確效。

蛋白質樣品所含的半胱胺酸(Cys)在標準酸水解條件下並不穩定，因此要定量這種胺基酸十分複雜。遺憾的是，這種胺基酸不同於Trp，用其他的酸水解或鹼水解方式獲得的均不盡理想。Cys分析有兩種常用程序，都需要將半胱胺酸轉換成更穩定的衍生物。第一種程序是將硫醇基烷基化，第二種程序則是氧化成遇酸能夠保持穩定的磺酸、磺基丙胺酸或三聚氰酸(Cya)。

警告：Cys分析更加困難的原因在於，這種胺基酸大多以二聚體胱胺酸(Cys2)形式存在，進行任何烷基化程序之前，都要先還原為半胱胺酸才行。

請務必注意，這些特定程序必須在標準酸水解步驟之前進行。

過氧甲酸是一種強效氧化試劑，能將半胱胺酸(Cys)和胱胺酸(Cys2)定量轉換成磺基丙胺酸(Cya)（圖4）。文獻記載了許多在各種不同條件下和程序中使用這類試劑的參考資料。下列程序以Tarr, G.E., 1986的參考資料為準。

註：這項程序對半胱胺酸及甲硫胺酸提供最準確的結果。

• 真空乾燥儀器
• 6 x 50 mm附蓋水解試管
• 超純甲酸
• 超純過氧化氫
• 分析天平
• 微量移液管

1. 在6 x 50 mm水解試管中以真空乾燥方式處理樣品（0.1–10 µg蛋白質或50–2000 pmol胜肽）。
2. 按19:1的體積比例混合97%甲酸與過氧化氫；蓋上蓋子，在22 °C下靜置一小時。
3. 取10 µL該試劑加入乾燥樣品中，在22 °C下靜置30分鐘，然後真空乾燥。
4. 按照標準的6 M HCl程序水解（請見第1.1節）。

註：Tyr和Trp在這個氧化程序中不穩定。

烷基化程序比過氧甲酸氧化更具選擇性，幾乎不會讓其他胺基酸產生變化。因此，烷基化比較適合用於分析完整蛋白質，以及其他可能遵循半胱胺酸修飾的程序，例如胜肽圖譜分析。

這種方法會以4-乙烯基吡啶進行烷基化；也可以按照數種烷基化試劑調整下方概述的一般程序。原則上，必須向樣品中加入足量的還原試劑，將胱胺酸(Cys2)轉換成半胱胺酸(Cys)。之後才向還原的樣品中添加過量烷基化試劑（圖5）。

• 真空乾燥機、氮氣乾燥源或凍乾機
• 可重複封口的樣品瓶
• 分析天平
• pH計
• 微量移液管
• 吡啶乙基半胱氨酸(PEC)，作為標準品
• 鹽酸胍(Gu-HCl)
• 二硫蘇糖醇(DTT)
• 4-乙烯基吡啶(4-VP)
• N-乙基嗎啉乙酸酯
• 超純乙酸
• 胺基酸標準品（零件編號：WAT088122）

1. 向6.4 mL的N-乙基嗎啉乙酸酯中添加水，定容至100 mL。
2. 使用乙酸滴定至pH 8.3。

下列程序可用於1–1000 nmol的蛋白質或胜肽。

1. 將樣品放入可密封的樣品瓶中；真空乾燥、氮氣或凍乾。
2. 用1 mL緩衝液溶解樣品。
3. 添加1 g Gu-HCl。混合。
4. 添加4 mg DDT。混合。
5. 以氮氣覆蓋樣品、密封蓋緊，在室溫下培養４小時。
6. 添加8 µL 4-VP，以氮氣覆蓋、密封，在室溫下培養4–16小時。
7. 加入3 mL 水。
8. 去鹽。
9. 現在對樣品進行酸水解。

註：將緩衝液減少至0.25 mL、Gu-HCl減少至250 mg、DTT減少至1 mg，4-VP減少至2 µL，就能縮小總反應體積。這些體積足以用於最多250 pmol樣品。烷基化之後，以750 µL H₂0稀釋再繼續。

1. 製備2.5 mM吡啶乙基半胱氨酸(PEC)溶液。
2. 加入200 µL胺基酸標準品。
3. 取10 µL合併的PEC校準混合物進行衍生化。
4. 以100 µL溶液回溶；注入4 µL，在250 pmol的濃度下校準。

註：8 µL 4-VP大約是74 µmol。若要以其他烷基化試劑取代程序中使用的4-VP，例如碘乙酸，可以使用相同的試劑濃度。