胺基酸水解與分析綜合指南

胜肽和蛋白質含許多以胜肽鍵結合的胺基酸。這些生物分子又構成不同的樣品，例如生物治療藥物、食品和飼料。要分析這些生物分子所含的胺基酸，一定要將胜肽鍵水解，形成游離胺基酸。不過，在這個流程中，共軛胺基酸鍵不同的化學性質可能會影響裂解胺基酸鍵的效率以及單項胺基酸的回收率。例如，特定化學反應、試劑基質干擾以及胺基酸本身的穩定性，都有可能影響水解過程中的胺基酸回收率。

有鑑於樣品和胺基酸的化學與物理性質存在諸多差異，過去幾年來開發出數種不同的水解程序。各項程序的反應類型（化學反應或酶反應）、化學反應性質（酸性或鹼性），以及反應的物理狀態（液相或汽相）各不相同。這些差異可能會影響特定胺基酸的回收率（特定試劑可能會破壞這些胺基酸），也可能會影響水解的效率和所需時間。在某些情況下，可能需要進行多項水解程序才能確定樣品所含的總胺基酸含量。下方說明常見的化學水解反應類型與水解模式。

註：酶水解非常見程序，故本文件不列入說明。

另請注意，許多化學水解反應可以使用不同類型的設備進行。過去的水解程序通常會使用真空熱源完成反應，但現代設備也會廣泛使用微波誘導的水解。兩種方式各有不同優點，選擇設備之前應仔細研究。

1.1.1 酸水解

酸水解是最普遍的蛋白質樣品水解方法，在汽相或液相中都可以進行。這類反應固然可以使用許多不同的酸，但最常用的是6 M HCl。HCl會蒸發，因此也可用於回收少量緩衝液中的水解物，這一特色對處理少量樣品特別有用。再者，HCl用途廣泛，液相或汽相水解都能使用。

使用6 M HCl進行的酸水解反應會在每個共價胜肽鍵添加水，產出所需的單項胺基酸（圖1）。不過，並非所有胺基酸皆可在使用HCI進行水解的情況下完全回收。有些胺基酸會水解成酸式，例如天門冬醯胺和麩醯胺，兩者分別會形成天門冬胺酸和麩胺酸。此外，其他胺基酸的量測結果並不可靠。例如，色胺酸會在反應過程中遭到破壞，而含硫胺基酸（例如半胱胺酸、甲硫胺酸）則無法得到可靠的量測結果，因為胺基酸已有一部分遭到破壞。再者，諸如酪胺酸、絲胺酸和蘇胺酸這類胺基酸的回收率可能較低，原因在於酸水解的性質。

不過，倘若進行前處理，有些含硫胺基酸（例如半胱胺酸、甲硫胺酸）是可以在以HCI進行的酸水解中保留的。要準確定量這些胺基酸，可以先將樣品氧化或烷基化，再以HCI進行酸水解。氧化通常會使用過氧甲酸，在以HCI進行酸水解之前將含硫胺基酸氧化。這樣就能以氧化形式準確定量這些胺基酸。烷基化也可以保留含硫胺基酸（半胱胺酸），以烷基化形式準確定量。兩種最普遍的烷基化試劑可以產生氧化形式或烷基化形式的半胱胺酸，也就是吡啶乙基半胱胺酸或羧甲基半胱胺酸。這項烷基化流程的另一個優點是不會影響其他胺基酸。

最後，由於HCl水解難以定量某些胺基酸，因此可以針對特定胺基酸應用其他酸水解技術。其中一項技術使用甲磺酸(MSA)之類的磺酸定量色胺酸和甲硫胺酸（亞碸形式）。這項試劑不易揮發，但能保留色胺酸和甲硫胺酸亞碸以利定量。

1.1.2 鹼水解

使用HCl的酸水解目前是最普遍的蛋白質和胜肽水解技術，而鹼水解則常用於量測色胺酸。色胺酸在鹼性條件下可以保持穩定，因此這項技術能準確定量色胺酸，也廣泛用於從食品與飼料到胜肽和蛋白質等多種樣品。鹼水解使用的試劑通常是NaOH或KOH。不過，鹼水解不能取代酸水解用於定量所有胺基酸。在鹼性條件下，精胺酸、半胱胺酸、絲胺酸和蘇胺酸會遭到破壞，無法定量。其他胺基酸也會受到影響，因此鹼水解通常只用於色胺酸。

水解反應要在液相或汽相中進行。不論哪一種模式，水解專用儀器都有助於促進反應。過去許多水解反應在高溫狀態下發生，且須經過數小時到數天的長時間真空，但微波水解儀器問世後，同樣的流程在低溫狀態下只要幾分鐘就能完成。

1.2.1 液相水解

在液相水解中，樣品和HCl均直接添加到水解試管中反應。這個程序需要將樣品、內標準品和酸直接添加到水解試管中。使用氮氣沖洗試管後，將試管密封並加熱到水解完成為止。完成液相水解所需的時間從數小時到數天不等。這項程序通常用於較複雜的樣品。

1.2.2 汽相水解

在汽相水解中，樣品只與汽相狀態的HCI產生反應。這個程序需要將樣品和內標準品（如有使用）放入水解試管中，等樣品乾燥後，再將每支管子開蓋放入水解瓶中。向放有試管的水解瓶底部加入酸(6 M HCl)，再將水解瓶密封起來排空，並以氮氣沖洗。將水解瓶加熱到水解完成為止。這種模式能降低任何不純試劑（如HCI）所造成的污染。汽相水解的速度通常比液相水解快。汽相水解通常需使用高純度樣品。