胺基酸水解與分析綜合指南

食品與飼料由化合物組成，其中含有生長和營養必不可少的胺基酸。分析胺基酸含量是保障適度營養的重要步驟。不過，這些產品都是透過批量製程生產的。就像生產藥物一樣，批量製程得到的產品在生產過程中可能有變。因此必須考量代表性樣品的組成。此時通常需要採用二次採樣策略。要對這類產品執行胺基酸分析，需要以多種方法正確分析樣品的總蛋白質組成。由於食品與飼料採批量生產方式，並且含有非蛋白質成分，因此建議進行液相水解。

註：半胱胺酸和甲硫胺酸等含硫胺基酸以及色胺酸在標準酸水解過程中不穩定，可以採用其他方法有效地分析這類胺基酸。

本節介紹三種不同的水解程序：

• 酸水解 – 測定蛋白質總含量和組成
• 過氧甲酸氧化 – 量測半胱胺酸及甲硫胺酸等含硫胺基酸
• 鹼水解 – 評估色胺酸回收率

分析蛋白質中結合的胺基酸時，必須讓胜肽鍵斷裂，以利分析游離胺基酸（圖1）。要水解飼料蛋白質樣品，應考量樣品材料的pH值以及固體存在情形。前幾節提到過，蛋白質所含胺基酸的水解速度或程度不盡相同。食品材料中結合的蛋白質尤其如此。不論採用何種水解方法，一定要仔細實驗後再選定參數。

分析飼料時，必須牢記三個樣品前處理因素：

1. 樣品處理
2. 水解的樣品量
3. 水解所用酸的體積

3.2.1 樣品處理

穀物飼料和類似樣品通常不均一。若要讓這類樣品盡可能均一，應研磨成細粉。若樣品脂肪含量高，可以先按標準程序脫脂，再進行最終研磨。細粉狀能充分發揮飼料蛋白質的水解成效。AOAC方法（4.1.11, 994.12b, J.AOAC Int.88, 2005，「飼料的胺基酸分析」）規定必須研磨試驗樣品，直到能夠通過0.25 mm或60目的篩子（顆粒大小是250 µm）。

3.2.2 樣品量

AOAC方法建議對飼料的胺基酸分析使用以下計算公式確定飼料分析中使用的樣品量。

按照以下公式計算供試部分的約略量：

Ws = 1000/Ns

其中，Ns = 測試部分的含氮量(%)，Ws = 相當於10 mg含氮量的試驗材料重量(mg)。

通常，每個分析樣品的材料重量都在100–1000 mg範圍內。

3.2.3 酸體積

如前所述，必須要有大量過量的酸才能充分水解蛋白質樣品。飼料也是如此。不過，不同於第2.1.2節討論的100倍過量，在AOAC方法994.12中，添加的酸重量與樣品重量的比值範圍介於50-500倍。這個範圍結合飼料中有大量非蛋白質顆粒材料的事實表明，需要先仔細研究尋找範圍再進行例行飼料分析。

3.2.4 內標準品

使用內標準品(IS)能對樣品中單個胺基酸的可變水解發揮最好的補償作用。Waters建議在UPLC分析中使用AccQ•Tag Ultra時以正纈氨酸(Nva)作為IS，在HPLC分析中使用AccQ•Tag時以α-胺基丁酸(AABA)或正白胺酸作為IS。AOAC方法994.12建議的飼料分析內標準品是正白胺酸。選擇IS要謹慎，確保在層析分離的胺基酸訊號峰之間能夠達到理想的解析度。

3.2.5 AOAC 994.12「飼料中的胺基酸」

文獻記載了各種方法，可調整後用於飼料的胺基酸分析。本文介紹的方法是依據AOAC方法994.12「飼料中的胺基酸」所調整的。

• 分析天平，讀數誤差±0.1 mg
• 上皿式天平
• 聚乙烯瓶，50 mL
• 分解管，可以使用燒瓶
• 分解塊，可以使用加熱包或水浴
• 過濾裝置，0.22 µm（可以使用Millex GS、Millipore）
• pH計，以pH 2.0、4.0和7.0的緩衝液校準
• 回流冷凝器
• 旋轉蒸發儀
• 玻璃燒杯，250和1000 mL
• 錐形瓶，150 mL
• 圓底蒸發瓶，1000 mL
• 量筒，100、500和1000 mL
• 定量瓶，1000 mL
• 定量移液管，10和20 mL
• 燒結玻璃濾器，孔隙度10–15 µm
• 注射筒

• DL-正白胺酸結晶
• 濃鹽酸
• 30%氫氧化鈉溶液(30 g/100 mL)
• 苯酚結晶
• 98%硫二甘醇溶液
• 二水合檸檬酸三鈉鹽
• pH緩衝液，pH 2.0、4.0和7.0

檸檬酸鈉緩衝液—pH 2.20

1. 稱取19.60克二水合檸檬酸三鈉鹽加入1000 mL燒杯中。
2. 使用大約800 mL H₂O溶解。
3. 一邊攪拌一邊加入10 mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。
4. 將溶液定量轉移到1000 mL定量瓶中，使用H₂O稀釋到刻度處。
5. 以燒結玻璃濾器過濾緩衝溶液。
6. 以HCl或2 M NaOH調節pH到2.20。

6 M HCl–苯酚溶液

1. 稱取1 g苯酚結晶置於扣重的1000 mL燒杯中。
2. 將結晶溶於500 mL H₂O中。一邊攪拌一邊緩緩加入500 mL HCl。

鹽酸溶液—1 M

1. 將大約800 mL H₂O倒入1000 mL定量瓶中。
2. 使用移液管添加83.3 mL HCl。
3. 使用H₂O稀釋到刻度處並充分混合。

鹽酸溶液—0.1 M

1. 將大約800 mL H₂O倒入1000 mL定量瓶中。
2. 使用移液管添加100 mL 1 M HCl。
3. 使用H₂O稀釋到刻度處並充分混合。

氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)

1. 稱取80.0 g NaOH置於扣重的1000 mL燒杯中。
2. 在燒杯中加入約600 mL H₂O使顆粒緩緩溶解。
3. 待溶液冷卻後，將溶液定量轉移到1000 mL定量瓶中。
4. 使用H₂O稀釋到刻度處並充分混合。

內標準品溶液

1. 準確稱取195–200 mg DL-正白胺酸結晶置於扣重的150 mL錐形瓶中。
2. 使用100 mL 1 M HCl溶解。
3. 將溶液定量轉移到1000 mL定量瓶中，使用H₂O稀釋到刻度處。

1. 準確稱取100–1000 mg磨細的試驗樣品，精確到0.1 mg（相當於約10 mg含氮量），置於貼有標籤的分解管中。按照上一節所述的計算公式確定實際樣品用量。
2. 將50 mL 6 M HCl-苯酚溶液加入稱好的一份樣品中稍微攪拌。向溶液中加入2–3片沸石。
3. 在排煙櫃中使用加熱塊或水浴以平衡溫度110–120 °C回流水解24小時。
4. 取下在加熱的分解管，冷卻到室溫。
5. 使用定量移液管向每份測試溶液中加入20 mL正白胺酸內標準品溶液。搖晃燒瓶混合溶液。
6. 使用燒結玻璃濾器將水解物過濾到貼有標籤的1000 mL圓底蒸發瓶中。
7. 將燒瓶接在旋轉蒸發儀上，以60 °C蒸乾溶液。
8. 加入約20 mL H₂O清洗，並重複蒸發。重複清洗和蒸發步驟兩次。
9. 從蒸發儀中取出燒瓶。
10. 將50 mL檸檬酸鈉緩衝液加入蒸發後的水解物中，充分混合，再轉移到貼有標籤的50 mL聚乙烯瓶中。
11. 樣品製備完成，可以準備進行衍生化。

半胱胺酸和甲硫胺酸是飼料分析中相當重要的胺基酸；兩者對食用飼料的動物均有生長限制作用。由於標準酸水解條件不適用於這幾種特定的胺基酸，因此，通常會另外選擇過氧甲酸氧化方法。這種方法會將半胱胺酸和胱胺酸轉成三聚氰酸，將甲硫胺酸轉成甲硫胺酸碸（圖3）。接下來即可對樣品進行酸水解並充分衍生化。

文獻中記載了多種版本的過氧甲酸氧化方法。這些方法整體流程相似，但具體細節不同。本指南介紹兩種入門程序。第一種方法的參考來源是AOAC 994.12。第二種則是依據MacDonald et al, 1985的替代方法。開始採行任何一種具體方法之前，必須仔細評估並進行最佳化。

• 分析天平，讀數誤差±0.1 mg
• 上皿式天平
• 聚乙烯瓶，50 mL
• 分解管，可以使用燒瓶
• 分解塊，可以使用加熱包或水浴
• 過濾裝置，0.22 µm（可以使用Millex GS、Millipore）
• pH計，以pH 2.0、4.0和7.0的緩衝液校準
• 回流冷凝器
• 旋轉蒸發儀
• 玻璃燒杯，250和1000 mL
• 錐形瓶，150 mL
• 圓底蒸發瓶，1000 mL
• 量筒，100、500和1000 mL
• 定量瓶，1000 mL
• 定量移液管，10和20 mL
• 燒結玻璃濾器—孔隙度10–15 µm
• 冰浴
• 注射筒

• 88%甲酸
• 30%過氧化氫
• 偏亞硫酸氫鈉
• DL-正白胺酸結晶
• 濃鹽酸
• 30%氫氧化鈉溶液(30 g/100 mL)
• 苯酚結晶
• 98%硫二甘醇溶液
• 二水合檸檬酸三鈉鹽
• pH緩衝液，pH 2.0、4.0和7.0

檸檬酸鈉緩衝液—pH 2.20

1. 稱取19.60克二水合檸檬酸三鈉鹽加入1000 mL燒杯中。
2. 使用大約800 mL H₂O溶解。
3. 一邊攪拌一邊加入10 mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。
4. 將溶液定量轉移到1000 mL定量瓶中，使用H₂O稀釋到刻度處。
5. 以燒結玻璃濾器過濾緩衝溶液。
6. 以HCl或2 M NaOH調節pH到2.20。

6 M HCl–苯酚溶液

1. 稱取1 g苯酚結晶置於扣重的1000 mL燒杯中。
2. 將結晶溶於500 mL H₂O中。一邊攪拌一邊緩緩加入500 mL HCl。

鹽酸溶液—1 M

1. 將大約800 mL H₂O倒入1000 mL定量瓶中。
2. 使用移液管添加83.3 mL HCl。
3. 使用H₂O稀釋到刻度處並充分混合。

鹽酸溶液—0.1 M

1. 將大約800 mL H₂O倒入1000 mL定量瓶中。
2. 使用移液管添加100 mL 1 M HCl。
3. 使用H₂O稀釋到刻度處並充分混合。

氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)

1. 稱取80.0 g NaOH置於扣重的1000 mL燒杯中。
2. 在燒杯中加入約600 mL H₂O使顆粒緩緩溶解。
3. 待溶液冷卻後，將溶液定量轉移到1000 mL定量瓶中。
4. 使用H₂O稀釋到刻度處並充分混合。

內標準品溶液

1. 準確稱取195–200 mg DL-正白胺酸結晶置於扣重的150 mL錐形瓶中。
2. 使用100 mL 1 M HCl溶解。將溶液定量轉移到1000 mL定量瓶中，使用H₂O稀釋到刻度處。

過氧甲酸試劑

1. 在排煙櫃中製備。稱取25 mg苯酚結晶置於25 mL試管中。
2. 使用微量移液管加入0.5 mL 30% H₂O₂。
3. 加入4.5 mL 88%甲酸溶液。
4. 用瓶塞蓋住試管，讓混合物在室溫下靜置30分鐘。
5. 30分鐘後，將試管放入冰浴中，讓過氧甲酸混合物冷卻15分鐘。
6. 試劑在使用前臨時製備。

1. 準確稱取100–1000 mg磨細的試驗樣品，精確到0.1 mg（相當於約10 mg含氮量），置於貼有標籤的水解試管中。按照之前所述的計算公式確定實際樣品用量。
2. 在每一支試管中放入磁力攪拌器，再將分解管放入冰浴(0 °C)中。
3. 待過氧甲酸和測試部分冷卻至少15分鐘後，在每支分解管中加入5 mL過氧甲酸試劑；用瓶塞或瓶蓋蓋好所有試管，攪拌15分鐘。
4. 將分解管放回冰浴內，讓樣品氧化16小時。
5. 拿掉玻璃塞，加入約0.84 g偏亞硫酸氫鈉以分解過氧甲酸。攪拌15分鐘，釋放SO₂。
6. 現在樣品製備完成，可以進入酸水解階段。

1. 將50 mL 6 N HCl–苯酚溶液加入稱好的一份樣品中稍微攪拌。向溶液中加入2–3片沸石。
2. 在排煙櫃中使用加熱塊或水浴以平衡溫度110–120 °C回流水解24小時。
3. 取下在加熱的分解管，冷卻到室溫。
4. 使用定量移液管向每份測試溶液中加入20 mL正白胺酸內標準品溶液。搖晃燒瓶混合溶液。
5. 繼續下方的步驟(a–d)或(e–g)。
   1. 使用燒結玻璃濾器將水解物過濾到貼有標籤的1000 mL圓底蒸發瓶中。
   2. 將燒瓶接在旋轉蒸發儀上，在真空狀態下以40 °C蒸發至大約0.5 mL。註： 不要蒸乾溶液。
   3. 從蒸發儀中取出燒瓶。
   4. 將50 mL檸檬酸鈉緩衝液加入蒸發後的水解物中，充分混合，再轉移到貼有標籤的50 mL聚乙烯瓶中。
   5. 以燒結玻璃濾器將水解物過濾到250 mL真空瓶中，然後將濾液移入250 mL燒杯中。
   6. 將燒杯放入冰浴中。
   7. 一邊攪拌一邊用大約40 mL 7.5 M NaOH部分中和水解物。（註：溫度不能超過40 °C）。 使用2 M NaOH調節pH至2.20。

     6.樣品製備完成，可以準備進行衍生化。

註：文獻對這項分析記載了許多不同的參考資料。所有參考資料註明的過氧甲酸和溴化氫用量以及蒸發溫度均不相同。變更用量和/或溫度會影響步驟7的蒸發時間。

• 25 x 150 mm附蓋試管
• 冰塊和冰浴
• 定量移液管
• 真空蒸發儀
• 乾淨的氮氣源
• 烘箱或加熱塊
• 玻璃量具
• 過氧甲酸
• 過氧化氫
• 甲酸
• 超純水
• 48% HBr溶液（按重量）

1. 按1:9的體積比例混合30%過氧化氫和88%甲酸。
2. 讓混合物靜置1小時並不時搖晃。
3. 將混合物放入冰浴中30分鐘，然後立即使用。

1. 稱取相當於20 mg蛋白質的樣品（精確到mg）放入25 x 150 mm試管中。
2. 將樣品放入冰浴中30分鐘。
3. 向樣品中加入10 mL冷過氧甲酸，輕輕搖晃，然後蓋上鐵氟龍內襯蓋。
4. 將樣品（仍然放在大量冰塊中）放入冰箱，以0 °C存放一夜（16小時）。
5. 16小時後，在樣品溫度仍是0 °C的情況下，依序添加3滴辛醇和3 mL冷卻的48% HBr，緩緩搖晃樣品。請在排煙櫃中執行這個步驟。將樣品在0 °C下靜置30分鐘。
6. 使用真空蒸發儀以37 °C蒸乾溶液，此過程約需1–2小時。
7. 向試管中加入5 mL 6 N HCI。用氮氣吹掃30秒，然後立即蓋上蓋子。
8. 將樣品放入110 °C的烘箱內24小時。
9. 自烘箱中取出放涼。
10. 添加10 mL 5.0 µmol/mL的操作內標準品，充分混合。註：計算所用內標準品的實際濃度時，應以能在儀器注入等量的樣品為準。
11. 將樣品定量轉移到250 mL定量瓶中，以HPLC級水沖洗樣品試管，再用清洗液定容至刻度處。
12. 使用0.45 µm樣品濾器過濾約1 mL步驟12的樣品。若不立即進行衍生化，請將加蓋的樣品存放在冰箱中。註：離心處理可以取代這個過濾步驟。離心處理可得到澄清的上澄液。

在酸水解的標準條件下，色胺酸(Trp)不穩定，無法發揮分析成效。建議改用鹼水解釋放及分析飼料中的這種胺基酸。該方法使用4.2 M NaOH水解蛋白質，優點是完成水解後不需要進行衍生化步驟。只需要以280 nm的UV偵測進行儀器分析即可。

本節介紹的程序是依據AOAC方法988.15「食品和食品與飼料成分中的色胺酸」所調整的。

• 改造過的微量克爾達瓶（可向Ace Glass, Inc.購買）– 25mL微量克爾達瓶（內徑12 mm，頸長15 cm）。瓶頸收縮至內徑大約6 mm，在燒瓶球型上方5 cm處。
• 真空幫浦
• 0.45 µm薄膜過濾儀器和濾器
• 乾冰
• 水浴
• 水浴用的乙醇
• 定量移液管和玻璃器皿
• pH計

• 以Milli-Q系統(Millipore Corp.)或同級設備製作的純水
• 4.2 M NaOH
• 1-辛醇
• pH 4.25的檸檬酸鈉緩衝溶液
• HCl
• 色胺酸標準品溶液
  • 原液—1 mg/mL。將250 mg L-色胺酸溶解於100 mL含六滴HCI的H₂O中。用H₂O稀釋至250 mL。
  • 操作溶液I—0.1 mg/mL。取10 mL原液用H₂O稀釋至100 mL。
  • 操作溶液II—0.04 mg/mL。取4 mL原液用H₂O稀釋至100 mL。
  • 不使用標準品溶液時請冷藏。每月製備新鮮的溶液。

1. 在裝有1 mm網篩的離心研磨機中研磨實驗室樣品；充分混合。
2. 稱取一份含100 mg蛋白質的試驗樣品，放入改造過的微量克爾達瓶中。
3. 脂質含量>5%的試驗樣品：
   1. 向盛有稱好的測試部分的燒瓶中加入10 mL石油醚。
   2. 輕輕搖晃混合，並以超音波處理20分鐘。靜置沉澱。必要時進行離心處理。
   3. 以虹吸方式盡可能抽出石油醚，注意不要抽出任何固體。
   4. 在溫和的氮氣流下蒸發剩餘的石油醚。開始水解。
4. 脂質含量<5%的試驗樣品：直接進行水解。

1. 以氮氣發泡10分鐘，去除4.2 M NaOH所含的空氣。
2. 向每個燒瓶中加入10 mL去除空氣的4.2 M NaOH。
3. 加入3滴1-辛醇。
4. 立即將處理好的溶液放入乾冰/乙醇浴中冷凍。接著取出燒瓶，排空至10 mm。
5. 解除真空並密封燒瓶。
6. 將封好的燒瓶放在盛有H₂O的燒杯中，置於室溫下，直到測試溶液熔化。
7. 將燒瓶放入110 °C的烘箱內20小時。
8. 讓燒瓶冷卻到室溫。
9. 以1 mL pH 4.25的檸檬酸鈉緩衝溶液沖洗瓶頸，用燒杯盛裝清洗液。
10. 將水解物定量轉移到同一個50 mL燒杯中，以兩份pH 4.25的檸檬酸鈉緩衝溶液沖洗燒瓶。
11. 以3.5 mL HCl中和溶液並用力攪拌。調節pH至4.25 ± 0.05。
12. 將溶液定量轉移到25 mL定量瓶中，用H₂O稀釋到刻度處。
13. 將溶液倒入40 mL離心管中，以1150 G離心處理20分鐘。
14. 以玻璃濾紙(Whatman GF/A)過濾上澄液。
15. 將濾液移入離心管中，以23,000 G離心處理10分鐘。

註：此時您可以取一份上澄液進行UV (289 nm)分析，不需進行衍生化。