质谱入门指南

在质谱分析中，控制实验的能力极为重要。一旦在精心控制的条件下产生离子，就必须以适当的灵敏度作为离散事件来检测它们。得益于蒸气载量相当小的优势，GC成为了早期联用技术的理想选择，但它只适用于约20%的化合物。今天，向质谱仪中引入分析物进行电离最常用的技术是让LC洗脱液形成气溶胶，这种技术需要在真空环境下操作以确保操作受控。

对于任何质谱仪而言，泵送能力都是关键的设计元素之一。真空必须在仪器的稀薄大气区域内均匀分布，并且必须足以抵消离子入口尺寸和需要去除的蒸气量等设计要求。

LC-MS泵送要求取决于所用的入口。最终，这是推动API离子源开发的原因之一，API离子源在蒸气进入MS之前就能将其去除。

分析器是仪器分离或区分被引入仪器的离子的一种手段。离子源中会形成正离子和负离子（以及不带电的中性离子物质）。然而，仪器在给定时间点只能记录一种极性的离子。现代仪器可以在几毫秒内切换极性，即便用于快速的瞬态事件也能给出高保真度的记录，以超高效液相色谱(UPLC)或GC分离为例，这类分析中的典型峰宽仅为一秒左右。

四极杆质谱仪

1953年，西德物理学家Wolfgang Paul和Helmut Steinwedel发表了他们开发四极杆质谱仪的研究成果。他们的研究发现，施加叠加射频(RF)和恒定直流(DC)电势的四根相互平行的电极杆可用作质量分离器或滤质器，只允许特定质量范围内表现出恒定振幅的离子被分析器收集。

今天的仪器制造商致力于研发适合具体应用的四极杆质谱仪。单四极杆质谱仪需要干净的基质来避免不良离子的干扰，这类质谱仪表现出非常好的灵敏度。

三重四极杆质谱仪或串联四极杆质谱仪(MS/MS)在单四极杆仪器的基础上额外增加了一个四极杆，该四极杆可通过几种方式发挥作用。第一种方式是基于离子特有的质荷比(m/z)简单分离并检测复杂混合物中的目标离子。这个附加四极杆发挥作用的另一种方式是结合受控的碎裂实验使用。此类实验需要让目标离子与其他分子（通常是氩气等气体分子）碰撞。在这类应用中，母离子会碎裂成子离子，MS/MS仪器根据化合物特有的子离子组分来鉴定目标化合物。

四极杆分析器由四根电极杆组成，它们通常平行排列，由钼合金等金属材料制成。人们在开发设计四极杆仪器时灌注了大量的技术和科学心血。施加直流(DC)和射频(RF)场可诱导仪器质量分析器中的离子运动，再根据运动情况对质量不同的离子进行分类。通过操作软件系统地改变场强，实际上是改变了任何给定时间点被过滤或传输到检测器的m/z值。四极杆质谱仪的分辨率低于某些采用其他设计的质谱仪，如飞行时间(TOF)仪器。然而，四极杆是一种相对简单、易于使用且实用性很强的仪器，以相对较低的成本提供各种接口。

我们需要使用一些术语（详细的术语表见本入门指南的后面部分）来比较和描述MS性能。

分辨能力

分辨能力（通常缩写为“res”）是质谱仪分离两种质量的能力：

• 低分辨率 = 单位质量 = 1000
• 较高或中等分辨率 = 1000-10,000
• 高分辨率 = 10,000以上
• 极高分辨率 = 高达 3,000,000–5,000,000
• 有关分辨率的详细内容以及衡量分辨率的方法请参阅“质量精度和分辨率”部分。

精确质量数是化合物质量的理论精确值，而准确质量数是化合物质量的实测值，二者之间有一定误差（例如5 ppm）。准确质量数通常还用于指代一种测定技术而不是测得的质量数。精确质量数相关研究（例如，在期刊上发表或申请专有技术）的普遍接受标准是能够在仪器上得出理论质量数5 ppm范围内的测定结果：对于250 Da，5 ppm相当于1.25 mDa（切勿与“5 mDa”混淆，5 mDa对于250 Da来说相当于20 ppm）

MS/MS

这个术语描述了多种实验 - 多重反应监测(MRM)和单反应监测(SRM)。指监测母离子向子离子转变的过程（或称“碎裂”过程），相较于使用单级四极杆仪器的实验，这通常有利于提高选择性、专属性和/或灵敏度。在同一台仪器中串联使用两个质量分析器或设置两个质量分析区段。

三重四极杆质谱仪中有三组四极杆滤质器，但只有第一组和第三组四极杆用作质量分析器。近年来的设计增加了中间设备的功能，使其充分差异化（取代了早期的四极杆设计），因此改为使用术语“三重四极杆”或“串联四极杆”。第一个四极杆(Q1)用作滤质器，将选定的离子加速传输到Q2（也称为“碰撞室”）。尽管在某些设计中Q2与其他两组四极杆相似，但Q2上施加的RF仅用于传输离子，而不用于质量筛选。Q2中的压力比较高，离子会与碰撞室内的中性气体分子发生碰撞，导致离子通过碰撞诱导解离(CID)的方式碎裂。接下来，离子碎片被加速，进入Q3（另一个扫描滤质器），Q3将碎片分类后送入检测器。

碰撞诱导解离(CID)也称为碰撞激活解离(CAD)，是分子离子在气相中碎裂的机制之一，通常在真空条件下通过施加电势给分子加速，使其获得较高的动能，然后让分子与中性气体分子（如氦气、氮气或氩气）碰撞。一部分动能在碰撞后被转化或内化，导致化学键断裂，分子离子碎裂成更小的碎片。一些类似的“特殊用途”碎裂方法包括电子转移解离(ETD)、电子捕获解离(ECD)。请参阅“生物分子电离方法”部分。

从左侧进入的237 Da母离子在MS/MS碰撞室中碎裂。数据系统可以只显示目标碎片（而不是产生的全部碎片），从而得到比全扫描MS谱图更简单的谱图。就像您可以选择母离子一样，您还可以控制碎裂的程度。

反相HPLC

“反相”这个术语指的是正好与“正相”相反的色谱模式，即使用极性的流动相和非极性的[疏水]固定相。图S-2展示了使用这种方法分离含有三种染料的黑色混合物的结果。

在一些受监管的行业中，为了满足阳性化合物鉴定的规范，MRM通道计为1.5分“鉴定得分”(IPS)，而SIR迹线计为1.0分。因此，假设选择性足够高，为了让IPS达到3分，您需要使用2个MRM通道，或者3条SIR迹线。

扇形磁场或扇形场质量分析器是一种早期的仪器设计，尽管现在已经极少使用，但仍然存在（已被可以在ESI电离模式下运行的现代ESI仪器取代）。例如，Waters AutoSpec普遍用于极高灵敏度的二噁英分析。

扇形磁场会导致离子运动轨迹呈弧形弯曲。离子的“动量-电荷”比决定了轨迹的半径，而轨迹本身由电场和/或磁场强度决定。离子的m/z越大，运动轨迹就越长。通过改变磁场强度可以控制运动路径。双聚焦质谱仪以各种组合将磁场和电场结合在一起，其中较为常见的是在扇形电场之后设置磁场。这种最早的混合系统利用扇形电场增大离子离开离子源时的动能，以此来聚焦离子。高能聚焦之后的角聚焦步骤可分离名义质量数相同但化学式不同的离子。

离子阱仪器的工作原理类似于四极杆仪器。然而，与过滤流动离子的四极杆仪器不同，离子阱和功能更强大的离子回旋(ICR)仪器会将离子储存在三维空间中。在饱和之前，离子阱或回旋加速器可根据离子质量数喷射指定的离子供检测器检测。离子阱内部可进行一系列实验，碎裂目标离子，以便根据碎片离子更好地定义母离子。通过对堆叠式或“三明治”式的几何结构（两端设置端盖电极）施加RF电压产生的电场会将离子捕获到两个电极之间的空间中。爬升或扫描RF电压可使处于长期频率或捕获状态的离子被喷射出来。然而，动态范围往往受限。用于离子的体积和容纳空间有限，导致仪器的测定范围受到限制，特别是对于复杂基质中的样品。

离子阱仪器最早于20世纪80年代问世。但是这些早期仪器都采用内部电离方案，因此性能受限，阻碍了它们在许多应用中的使用。随着外部电离这种设计的出现，这类仪器才变得更为普遍实用。

通过连续碎裂单个分析物获取更多结构信息的能力（即碎裂离子，选择特定碎片离子并重复碎裂过程）称为MSn。GC色谱峰的峰宽不足以执行多次碎裂（MS/MS或MS2）。离子阱仪器执行的MS/MS或碎裂实验基于时间而非空间，这与四极杆和扇形磁场仪器类似。因此它们不能用于某些MS/MS实验，例如中性丢失和母离子比较。此外，在使用离子阱仪器的MS/MS实验中，MS/MS谱图的最后三分之一会丢失，这是使用离子阱的后果。为了补偿这种损失，一些制造商的软件允许用户设置更宽的扫描范围，这需要在数据采集期间切换操作参数。

离子阱设计给母离子质荷比(m/z)与可捕获碎片离子的最低质荷比这二者之间的比率设置了一个上限，通常称为“三分之一规则”。例如，由m/z 1500的母离子产生的碎片离子，如果其m/z低于500，仪器是检测不到的 - 这对肽的从头测序而言是一个重大限制。离子阱的动态范围有限，这是过多离子进入捕获空间时，空间-电荷效应导致的后果。已有制造商开发出自动扫描功能，可在离子进入离子阱之前对离子计数，从而限制或门控(gating)进入离子阱的离子数。如果相对少量的目标离子存在于大量背景离子中，分析难度可能仍然很大。

鉴于功能设计相似，离子阱与四极杆被组合起来，通过结合四极杆的离子流优势和离子捕获行为的优势来提高灵敏度，实现单独使用两种仪器中的任何一种都无法完成的即时(on-the-fly)实验。（这类仪器有时被称为线性离子阱或Q-Trap）。线性离子阱仪器（相较于三维离子阱）的体积增加扩大了仪器的动态范围。

离子阱仪器不会像四极杆仪器那样运行扫描，因此在离子阱中使用单离子监测(SIM)或单离子记录(SIR)技术并不能像用于四极杆和扇形磁场仪器那样提高灵敏度。

快速傅立叶变换离子回旋(FTICR)质谱仪代表了当前测量质量数的最强能力，此技术可分辨密切相关的质量数。虽然对于大多数应用来说不切实际，但14.5特斯拉的磁通量密度可以实现超过350万的分辨率，从而显示质量数变化小于单个电子质量数的分子实体之间的差异。

回旋加速仪器利用恒定磁场在回旋池中静电捕获离子。RF电压脉冲使得离子沿固定轨道运动，沿轨道运动的离子会在回旋池的检测板上产生低强度的信号（离子的轨道频率）。这个频率与离子的m/z成反比，信号强度与回旋池中具有相同m/z的离子数量成正比。在非常低的回旋池压力下，回旋加速仪器可以长时间维持离子的运动轨道，从而达到非常高的测定分辨率。

持续偏共振、辐射、碰撞诱导解离(SORI-CID)是一种用于傅立叶变换离子回旋共振质谱的CID技术。离子在回旋加速器中运动加速，通过增大回旋加速器中的压力诱导离子碰撞并产生碎片。离子碎裂后降低压力并恢复高真空度，以分析碎片离子。

飞行时间(TOF)仪器虽然已经问世多年，但由于其采用了快速、精确的电子技术和ESI等现代电离技术，一直都是许多现代科研工作的基础。TOF仪器测定准确质量数的误差可低至分子真实质量的百万分之几(ppm)。作为一种时间分散型质量分析器，TOF仪器通常采用线性设计，或者辅以静电网格和透镜用作反射器。采用反射器时，可在不显著影响灵敏度或增大飞行管（或漂移管）尺寸的前提下提高分辨率。

TOF分析会使一组离子以短暂爆发的形式加速到达检测器。每个离子在离开离子源的时候都已经被“推斥极”施加了相同的电荷或电势。每个离子的电势会使离子加速到达（或者说将离子“发射”到）一根压力非常低的管中。由于所带类似电荷的离子都具有相同的动能（动能 = ½ mv²，其中m是离子质量，v是速度），因此质量较小的离子速度更快且撞击到检测器的时间间隔更短。质量数、电荷和动能共同决定离子到达检测器的时间，因此离子的速度可以表示为v = d/t = (2KE/m)^1/2。离子在时间(t)内移动给定距离(d)，而t取决于质荷比(m/z)。由于每一次“推斥”之后都会测定所有质量，TOF仪器可以达到远高于扫描仪器的灵敏度。

如今的四极杆MS系统通常以每秒10,000 Da或amu的速度运行扫描。所以全扫描，即便是持续时间很短的全扫描（例如扫描1 s的LC或GC峰）也能每秒扫描每个离子10次或更多次。TOF仪器的检测器可记录轰击检测板的时间间隔以纳秒计的离子。如果与四极杆等扫描仪器直接比较，这样的分辨率赋予了TOF仪器动态范围更宽和灵敏度更高的附加优势。不过，一般来说，四极杆仪器在检测复杂混合物中的目标分析物时更为灵敏，因此通常是更好的定量工具。某些仪器（例如离子阱）则兼具这些功能。但在混合型仪器出现之前，没有任何仪器可以单独在所有方面都展现出高阶性能。

早期的MALDI-TOF设计（使用基质辅助激光解吸电离技术）在电离后立即将离子加速送出电离源。它们的分辨率相对较差，且准确度有限。为MALDI-TOF仪器开发的延迟提取(DE)技术在离子形成后待其“冷却”并聚焦约150纳秒，然后再对离子加速使其进入飞行管。冷却后的离子动能分布更低，这最终有助于减小离子进入TOF分析器之后的时间分散性，从而提高分辨率和准确度。在分析大分子时（例如>30,000 Da的蛋白质），DE技术的优势明显较弱。

混合系统

“混合系统”一词适用于各种组合现有技术的质谱仪设计，例如双聚焦扇形磁场质谱仪，以及近年来出现的一种在回旋加速器“前”设置离子阱的仪器。其中，四极杆飞行时间(QTOF)质谱仪是最有趣的设计之一，该设计结合了TOF仪器与四极杆仪器。这种组合产生了好几项性能特征的理想结合：准确测定质量数、执行碎裂实验的能力和强大的定量能力。

质谱技术的进一步发展催生了组合离子淌度测定与串联质谱分离的仪器。离子淌度质谱（注意：由于“IMS”常被用作“成像质谱”的缩写，我在这里使用“IMMS”作为离子淌度质谱的缩写）是一种基于多种因素（包括离子的大小、形状、电荷以及质量）来区分离子的技术。IMMS设备通常应用于机场和手持式现场设备，可快速（只需20 ms）检测离子淌度值已知的小分子（例如某些麻醉药物和爆炸物）。应用于高阶仪器时，IMMS提供了一个正交的分离维度（相对于LC和MS）和一些特有的关键功能，包括：

• 分离异构体、同量异位素和构象异构体（从蛋白质到小分子）并确定它们的平均旋转碰撞截面
• 助力复杂混合物的分离（通过MS或LC-MS），帮助提高峰容量和净化样品（实现离子的物理分离，尤其是化学噪音和干扰目标分析物的离子）
• 可提供CID/IMMS、IMMS/CID或CID/IMMS/CID性能，还可以在结构表征研究中通过碎片实验获得更多有意义的信息。

在以上三种分析场景中，高效离子淌度和串联质谱的结合可以帮助您攻克其他分析方法（包括传统质谱或液相色谱仪器）无法解决的分析挑战。

本节末尾引用的H.H. Hill Jr.等人所著的综述文章比较了各种类型的离子淌度质谱仪（截至文章2007年发表时可用的质谱仪），并介绍了将这些仪器应用于多种分析物的优势。这篇文章主要介绍目前与质谱联用的四种离子淌度分离技术：

• 漂移时间离子淌度质谱(DTIMS)
• 吸取离子淌度质谱(AIMS)
• 差分淌度质谱(DMS)，也称为场非对称波形离子淌度质谱(FAIMS)
• 行波离子淌度质谱(TWIMS)

根据作者的说法，“DTIMS的IMS分离能力最强，是唯一可以直接测定碰撞截面的(IMMS)方法。AIMS是一种低分辨率淌度分离方法，但它可以连续监测离子。DMS和FAIMS兼具连续监测离子的能力和正交离子淌度分离能力，具有较高的分离选择性。TWIMS是一种新的(IMMS)技术，分离能力相对较低。不过，它表现出良好的灵敏度，并且能很好地集成到商业质谱仪的操作中。”

离子淌度仪器还能与MS相结合，用于研究生物分子的气相结构。Pringle等人（此处引用了他们的文献）使用四极杆/行波离子淌度分离器/正交加速飞行时间仪器组成的混合系统研究了某些肽和蛋白质离子的淌度分离。他们比较行波(TWIMS)分离装置获得的淌度数据与使用多种其他淌度分离器获得的数据后发现，“虽然淌度特性相似，但这套具有全新结构的混合型仪器可在不影响质谱仪基本灵敏度的情况下实现淌度分离。这种能力有助于研究人员在具有分析意义的水平上对样品进行淌度研究。”

另请参阅：

• Special Feature Perspective: Ion mobility-Mass Spectrometry, A. B. Kanu, P. Dwivedi, M. Tam, L. Matz and H. H. Hill Jr., J. Mass Spectrom.2008; 43: 1-22 Published online in Wiley InterScience, (https://onlinelibrary.wiley.com/) DOI: 10.1002/jms.1383
  • 文献要点：离子淌度-MS联用技术的简明概述。给出了160篇关于离子淌度质谱(IMMS)的参考文献。
    
• An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/traveling wave IMS/oa-ToF instrument, S. D. Pringle, K. Giles, J. L. Wildgoose, J. P. Williams, S. E. Slade, K. Thalassinos, R. H. Bateman, M. T. Bowers, J. H. Scrivens, Published online (www.sciencedirect.com), International Journal of Mass Spectrometry (2006), doi:10.1016/j.ijms.2006.07.021
  • 文献要点：介绍了IMMS在生物分子分析中的应用。