质谱入门指南

如今，更高的测定质量精度和分辨率已成为各类应用（例如早期药物发现）表征物质结构的主要工具。现在许多制造商的四极杆飞行时间(QTOF)仪器都达到了很高的专属性和实用性，正逐步取代其他LCMS技术。

尽管有更高阶的仪器，但QTOF仪器的质量精度非常高，可达到单同位素质量数真实计算值的百万分之几，再加上它的高分辨率优势（四极杆仪器的10倍），我们得以根据质量数亏损来确定经验式（将氢和其他原子的临界质量值作为区分因素）。形态分析 - 由于质量精度突破了四极杆的限值，达到30 ppm，QTOF仪器可以完成形态分析，例如辨别醛和硫化物这两种质量数只相差0.035 Da的物质。然而，如果要区分涉及甲基化的代谢过程，精度要求会更高。相较于先羟基化（添加氧）再在双键处氧化（H₂损失）这个分两阶段的生物转化过程（使质量数增加+13.9792 Da），增加一个CH₂会导致测定质量数在母离子质量数（药物本身的响应）的基础上增加+14.0157 Da。然而，如果只能达到名义分辨率（典型的四极杆响应），两种技术的测定结果看上去都像是+14 Da。

高质量精度和低分辨率

低分辨率四极杆仪器在对质量精度要求极高的测定中表现出色，用于蛋白质分析的四极杆仪器就是一个例子。如果同位素峰之间未实现分离，蛋白质的质量数通常被定义为“平均”值。平均质量数是分子中所有同位素的加权平均值。四极杆仪器通常采用的仪器分辨率将10 kDa蛋白质的分离响应扩大了1.27倍。这个因子会随质量数增加而显著增大（例如，质量数为100 kDa时可增大到2.65）。不过，如果不采用将仪器分辨率限制在1000的典型峰宽(m/z 0.6)，而是将峰宽减小至m/z 0.25（将分辨率提高到4000），可以大幅改善这种情况。

在实际应用中，使用ESI-MS分析大分子会产生多电荷离子。因此，需要将峰宽除以离子所带的电荷数，才能得到以质荷比为刻度的峰宽。例如，带10或20个电荷的20 kDa蛋白质在m/z约2000或约1000处分别产生峰宽为0.9或0.45m/z单位的同位素峰簇。

如果观察这些离子的仪器分辨率达不到观察同位素所必需的分辨率（例如分辨率低于10,000），则每个电荷态都会产生一个单峰。通过将仪器峰宽加上同位素峰簇理论峰宽除以离子电荷数来计算总峰宽。仪器峰宽根据m/z值与多电荷蛋白质峰相同的低分子量化合物的第一个同位素峰来确定。

需要达到或者实际能达到怎样的精度水平？有何代价？

我们来看看《美国质谱学会期刊》(Journal of the American Society for Mass Spectrometry)投稿人指南（2004年3月）对于“明确表征”的要求。对于C、H、O、N组分（_0-100个C、_3-74个H、_0-4个O和_0-4个N），只118处的名义质荷比响应只需不超过34 ppm的误差即可视为“明确”，而要求750处的m/z响应精度优于0.018 ppm以消除“所有外来物质的可能性”。

比较不同仪器的精度：毫质量单位(mmu)、测定误差(ppm)和分辨率

根据VIMMS计划（英国国家测量体系的举措之一）制定的准确质量数最佳实践指南(Accurate Mass Best Practice Guide)，大多数用于测定准确质量数的仪器都能达到10 ppm或更好的精度。

如果质量数计算值为118 Da，使用精度在2 mmu内的现代质谱仪进行测定，将显示17 ppm的误差，按照目前的标准，足以明确确定该质量数的化学式：

单同位素的精确质量数计算值 = 118 Da

实测准确质量数 = 118.002 Da

差值 = 0.002 mmu

误差 [差值/精确质量数 x 106] = 17 ppm

如果是一台能够在750 m/z产生响应的仪器，且精度也是2 mmu，则误差为2.7 ppm。在第一种情况下，根据《美国质谱学会期刊》的标准，测定结果完全足以明确鉴定化学式。但在后一种情况下，测定结果的精度就不合要求了。只有最高阶傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)才能在更高质量下达到这样的精度。

计算均方根或RMS误差是评估仪器质量精度测定能力是否匹配预期用途的一种综合方法。为了说明其用途，以下内容改编自商用TOF质谱仪的质量数测定精度指标。

“在正常操作条件下且使用合适的参比峰（给定m/z），基于对给定m/z的分析物峰的多次连续重复测定，仪器在给定m/z范围内的质量数测定精度应优于给定ppm RMS。分析物和参比峰必须具有足够的强度且不受其他质量的干扰。”

需要考虑下列要点和假设：

1. 已经使用校准标准品根据质量数已知的峰执行了仪器校准。参比峰用于说明仪器校准随时间的任何变化，质量数测定精度由分析物峰确定。
2. 正常操作条件 - 还可以包括（用于检查LC-MS性能指标的）色谱条件和任何相关MS操作条件（例如质量分辨率、目标m/z或谱图采集速率）的详细信息。
3. 足够的强度 - 假设离子计数对表征目标仪器的（质量数测定）准确度和精密度没有重大不良影响。离子过少会导致离子统计数据较差，离子过多会导致检测器饱和，这两种情况都会导致重复测定的标准偏差出现更大的变化，并对RMS误差的计算产生不利影响（也和仪器校准有关）。
4. 不受干扰 - 假设已知质量数峰的质量数测定不受相同或相近质量数离子的干扰。重叠峰会导致质量数测定准确度变差，这也不利于正确表征仪器的准确度或精密度（也和仪器校准有关）。
5. 参比峰能够很好地代表与特定样品类型的分析相关的m/z范围。

RMS误差的计算公式如下，其中E_ppm是ppm误差，n是考虑的质量数：

值得注意的是，RMS误差允许某些测定值超出ppm误差的“目标窗口”（例如，5 ppm RMS）。为了保证测定质量，必须在多次重复进样中满足上述条件（特别是关于强度和干扰的影响 - 得到平衡的离子统计数据，使谱图具有清晰的峰定义）。您看到的许多报告的分辨率和质量精度数值并不是RMS误差数值，而是源自某种选定的（有利的）离子。

切记，在所有应用中，弱信号（分辨率过高）会产生较差的离子统计数据，这些数据可能无法使用。过强的信号同样不可用，因为这种信号会导致检测器饱和。我们的目标是在谱图中得到可定义的、良好均衡的离子统计数据。

图中数据比较：

• 四极杆分辨率不足以区分上图中的两种化合物。
• 分辨率约为5000的TOF数据清楚地显示了两个不同的峰，且能准确测定它们的质量数，测定准确度< 5 ppm。

必须通过质量数定义和分辨率提高以及峰形和校准要求等因素之间的转变，了解决定准确质量数测定精密度的各种相互关联的作用。如果没有清楚地理解和考虑这些因素，可能会出现大量错误分配和其他不良结果。

图中元素组成不同的两个碎片离子来自相同的分析物，因此它们同时存在于源中。在这种情况下，即使是最好的色谱也无济于事，因此这凸显了高分辨率特别适用于未知物分析的原因之一。这对QTof子离子数据和三重四极杆的子离子数据同样适用。作为分辨率更高的附加优势，每个离子的提取离子流(XIC)图都支持从色谱图中选择性地区分含氧和含烷基分析物，而四极杆数据不具备这样的能力。

参考文献：MS - The Practical Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol.22 No.2, 118 – 130, February 2004
  • 文献要点：解答实际使用中的诸多核心问题并给出来自不同行业的比较
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol.26, No.3 March 2008
  • 文献要点：探讨高分辨率仪器的实用性并与现实期望比较。

另请参阅：

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004).VIMMS 2004 guidance document
  • 文献要点：简要概述对准确质量数测定工作取得成功至关重要的问题。
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie and D. A Volmer, Spectroscopy, Vol.22, No.6 June 2007
  • 文献要点：对于基本主题的扩展，包括Kendrick质量数亏损以及肽和蛋白质的标记。

磺胺二甲嘧啶名义质量数 = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

平均质量数 - 根据每种元素的所有同位素及其自然丰度计算。

磺胺二甲嘧啶平均质量数 = 278.3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

精确质量数计算值 - （单同位素）。通过对给定离子各同位素的质量数求和来确定。

磺胺二甲嘧啶精确质量数 = 278.0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

准确质量数 -（实际测得的“精确质量数”）。这是我们用仪器测得的结果。它是m/z的测定结果，报告值（通常）精确至三位或四位小数。

随着质量数增加，定义之间的差异会增加，此时峰形会发挥更大的作用：

泛素的名义精确质量数平均值

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560.6254 8565.8730