质谱入门指南

质谱图反映了实验中特定时间存在的特有离子，这段持续时间可以是在源中烧蚀固体样品的较长一段时间，也可以是GC或LC峰通过的短暂时间。分析人员可通过多个来源获得软件。软件通常针对特定应用量身定制，例如代谢物鉴定。它可以迅速精简海量的数据，同时突出肉眼可能忽略的问题。如果我们运用适当的技能，基于基础化学知识（例如含氮化合物的价电子规则、卤化物的特征谱图、环和双键的计算等）得出我们自己认为明确的结论，那么软件有助于降低结论的不确定性。没有一款软件应用程序能针对所有问题都给出令人满意的回答。因此，真正重要的是从业人员能否运用精湛的技能并基于各方面信息做出研判。

分析小而简单的分子时（如仅由三个原子组成的二氧化碳(44 Da)），产生的谱图也极为简单。对于CO，它的分子离子也是谱图中信号最强或丰度最高的离子（称为基峰）。在该谱图中，由电离的过量内能产生的碎片离子是CO (m/z=28)和O (m/z=16)。在某些情况下，谱图中丰度最高的离子可能并不是分子离子。例如，由于丙烷(44 Da)碳-碳键断裂会产生甲基和乙基碎片，因此丰度最高的是二者中较大的乙基正离子(m/z=29)。在这些烃类的谱图中，这些已得到充分表征的相互作用所产生的离子是非常重要的鉴别特征。

同位素特征

由于质谱仪按质量分离离子，所以只要仪器的分辨率足够高，就很容易区分给定元素的同位素。卤代化合物是一个经常被引用的示例，因为（例如）天然存在的溴元素是由原子质量分别为79和81 Da的两种同位素以大约50:50的比例组成的混合物。Br₂碎裂后生成溴正离子，然后在79和81 m/z处产生两个大小相等的离子峰。

偶电子离子和奇电子离子

大多数稳定的有机化合物都具有偶数个总电子，因为电子会成对占据原子轨道。从分子中除去单个电子后，总电子数变为奇数，随即形成自由基正离子。质谱图中的分子离子始终是自由基正离子（如EI谱图所示），但碎片离子可能是带偶数电子的正离子，也可能是带奇数电子的自由基正离子，具体取决于丢失的中性（不带电）碎片。最简单且最常见的碎裂是键裂，会产生一个中性自由基（带奇数电子）和一个带偶数电子的正离子。一种不太常见的碎裂是丢失带偶数电子的中性碎片，产生带奇数电子的自由基正离子碎片。

通常，奇电子离子可以碎裂为奇电子离子或偶电子离子，但偶电子离子只能碎裂为其他偶电子离子。

分子离子和碎片离子的质量数也反映了电子计数，这取决于分子中的氮原子数量。

解析质谱图的两个层面是名义质量数数据和精确质量数数据。在两种情况下，保留时间都是一个额外的决定因素。准确质量数的测定结果基于计算所得的元素组成。意料之中的是，将准确同位素模式输入算法以减少候选分子式数量是近年来准确质量数测定方法的开发方向之一。

表征解吸和软电离技术生成的质谱图

在解析质谱图时，一直以来我们的思考基础都是逆Diels-Alder反应以及解离或断裂化学键所需的均裂/异裂能量，它们会生成已经得到充分表征的特定碎片。Fred W. McLafferty是帮助我们理解质谱解析规则的重要贡献者之一，MS分析中的一大难点通常就是他提出的这个问题：“我们正在分析的质量数是什么？”

在诸如基质辅助激光解吸电离(MALDI)和电喷雾电离等解吸技术问世之前，这个问题至少在某些时候看上去还比较好回答。具体有多好回答，要取决于样品是否必须通过衍生化处理变得易挥发并适用于GC-MS。在这种情况下，质谱图中主要是衍生基团，只有很少或根本没有分子离子（因此需要CI）。在这种情况下，电喷雾和APCI的出现无疑有助于鉴别带单电荷的小分子物质的分子量。至少在这类分析中，MS分析的是只带单个电荷的离子的m/z值。分析物的质量数通常报告为分子离子的名义质量数（名义m/z值），该值与分子的名义质量数相等。离子、分子或自由基的名义质量数是其组成元素的名义质量数之和。元素的名义质量数是丰度最高的、天然存在的稳定同位素的整数质量数。

但是，随着电喷雾电离(ESI)等软电离解吸技术的商业化使用在20世纪90年代初开始普及，这个问题的答案变得更加难以捉摸。在MS的“解吸前”时代，通过MS分析的大多数分析物的名义质量数都小于500 Da。由于氢的存在而导致的质量数亏损对于这些分析物来说并不是问题。大多数质谱仪的m/z上限在650-800范围内。因此，在解吸电离技术尚未问世的时代，名义质量数和单同位素整数质量数的数值是相同的。离子、分子或自由基的单同位素质量数是其组成元素的单同位素质量数之和。元素的单同位素质量数是丰度最高的、天然存在的稳定同位素的精确质量数。

随着解吸电离技术时代的开启，由于相关技术可轻易实现大分子和高精度分析，这类分析成为了各类研究中不可或缺的组成部分。而质量数亏损这个问题的重要性也在此时凸显出来。如果使用只能报告最接近的整数m/z值的质谱仪，C₅₀H₁₀₂这种化合物的分子离子可能由m/z 703处而非m/z 702处的峰表示，因为该分子离子的单同位素质量为702.7825，四舍五入为整数703。

质量数大于500 Da时，质量数亏损可能成为确定MS峰m/z值时的一个严重问题。必须记住，质谱仪测定的是质谱图采集期间某个特定时间点出现的信号强度，这与使用什么类型的m/z分析器无关。仪器报告的m/z值是时间的函数，这个时间是特定化合物（相对于校准化合物）产生的m/z值已知的离子到达检测器的时间。

由于单同位素离子的质量数随着m/z范围内位置的变化而变化，因此报告整数m/z值的质谱仪实际上可以每隔0.05 m/z单位测定一次。检测到的强度可以是质谱峰顶点处的强度，也可以是整个质谱峰的强度之和。m/z报告值是对质谱峰信号最大值处观察到的m/z值四舍五入后获得的整数。

电子电离MS通常使用全氟化合物校准m/z范围，如全氟三丁胺（名义分子量为671）。这是因为离子的整数质量数几乎与该离子的单同位素质量数相同。一旦离子的名义质量数超过1000 Da，就无法在质谱图中观察到名义m/z值峰。单同位素质量数峰相对于应当观察到名义质量数峰的位置的偏移量等于离子的质量数亏损。对于质量数超过500 Da的单电荷离子，使用诸如电喷雾电离配合在整个m/z范围内都具有单位分辨率的传输四极杆或四极杆离子阱质谱仪这样的技术，可以清晰地分离同位素峰。

在众多有关同位素如何协助化合物鉴定的讨论中，有一篇发表于《LCGC》欧洲版的文章值得关注，这篇文章提出了一个很有用的平衡观点。Interpretation of Isotope Peaks in Small Molecule LC-MS（《小分子LC-MS分析中的同位素峰解析》(L.M. Hill, LCGC Europe 19(4), 226–238(2006)），这篇文章基于一项使用低分辨率离子阱仪器的研究。作者在相关部分中告诫大家，在使用离子阱时不要过度自信：“使用离子阱的分析人员必须比使用QTOF或三重四极杆系统的分析人员更加谨慎。显然，我们有必要从成功分离且未受污染的 +1 同位素峰开始 . . .离子阱捕获离子的分辨率往往低于它们运行扫描的分辨率 . . .按质量排序 . . .清空离子阱。”这并不意味着我们不能使用离子阱，而是必须在了解仪器能力和局限性的前提下使用，正如其他所有仪器一样。

同样，分辨率非常高的仪器也不能自动给出正确的答案。Kind和Fiehn（T. Kind和O. Fiehn）在一篇论文中（BMC Bioinformatics 7, 234(2006)）展示了一组让人颇为惊讶的数据集，他们在分析160万个分子式的搜索结果后得出了这样的结论：“仅凭高质量精度(1 ppm)和高分辨率不足以 . . .只有同位素丰度模式过滤器能够减少候选分子式的数量。”质谱仪的质量精度仅为3 ppm，但2%的同位素模式准确度通常可以筛除95%以上的错误候选分子式。这种性能甚至可以击败精度达0.1 ppm（如果真的有精度如此之高的仪器）但不具备同位素模式功能的质谱仪。

在150 Da-900 Da之间，如果没有同位素丰度信息的帮助，则质量精度从10 ppm增加到0.1 ppm时，列为候选分子式的数量如下：精度为10 ppm时，候选分子式从150 Da处的仅2个增加到900 Da处的3447个。即使在上限900 Da处，仅仅1 ppm的质量精度也产生了345个候选分子式。调用2%的同位素丰度准确度后，900 Da处的候选分子式数量有效减少，仅为18个。他们还指出，在5 ppm精度的基础上采用5%这个可谓“微不足道”的同位素采集准确度，产生了196个候选分子式。

参考文献：MS - The Practical Art, LCGC

• Interpretation of Mass Spectra, Part I: Developing Skills, Vol.24, No.6, June 2006
• Interpretation of Mass Spectra, Part II: Tools of the Trade, Vol.24, No.8, August 2006
  • 文献要点：这篇文章介绍了质谱专家如何解析质谱仪输出的数据。
• Techniques for structure elucidation of unknown: finding substitute active pharmaceutical ingredients in counterfeit medicines, Vol.25, No.6, June 2007
  • 文献要点：通过一个全面的真实案例研究说明MS如何在推断正确答案的过程中发挥作用。

另请参阅：

• Interpretation of Mass Spectra, Fred W. McLaffferty and Franisek Turecek, University Science Books, Sausolito, CA 1993 (4th ed.)
  • 文献要点：帮助您理解解析规则和方法的经典文本和表格。