质谱入门指南

电子轰击电离(EI)

许多人都很熟悉电子轰击电离(EI)。（有时人们会使用早期术语“电子撞击”- 但从技术上讲这个术语是不正确的）。EI通常是通过使样品暴露于70 eV的电子来实现电离，被称为一种“硬”电离技术。与目标分子相互作用的电子的能量通常远高于分子内化学键的能量，因此分子会发生电离。多余的能量会以已经得到充分表征的方式破坏化学键，产生可预测且可鉴别的碎片，我们可以据此推断出分子的“身份”。只从外电子层中去除一个电子，可产生正离子模式(M+)的自由基正离子和丰富的碎片离子谱图。某些更“软”的大气压电离技术产生的质谱响应有时取决于各制造商特有的离子源设计，而EI和这些技术不同，它的质谱响应完全独立于离子源设计。因此使用两台EI仪器分析同一化合物可产生基本相同的谱图，这有助于创建谱库用于匹配未知物与参比谱图。

化学电离(CI)

为避免分子过度碎裂，我们需要“软”电离技术。化学电离(CI)通过更温和的质子转移过程产生离子，这个过程可以保留分子本身的外观，促进形成分子离子。样品被暴露在过量的反应气中，例如在形成加氢分子离子(M+H)的过程中发生演变的甲烷。此过程反过来可以生成负离子。在某些情况下，将质子转移到气体分子上会产生负离子(M-H)。

化学电离(CI)有时会被用于分析化学性质与EI适用的分析物相似的化合物，用于改善倾向于过度碎裂的分子离子的丰度或外观。与EI分析类似，样品必须具有热稳定性，因为在离子源中加热会导致样品气化。CI电离的初始步骤依赖于EI电离机制，但CI源内充满了高压化学反应气，例如甲烷、异丁烷或氨气。浓度远高于分析物的反应气(R)经电子轰击电离产生初级反应离子R+。R+离子与中性R分子发生碰撞，形成稳定的二次离子，这些就是之后将通过离子-分子反应使分析物分子(A)电离的反应离子。

例如，甲烷离子与甲烷分子之间发生离子-分子反应之后，会产生相当稳定的CH₅⁺离子。

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

反应离子CH₅⁺可通过质子转移、去氢或电荷交换使中性分析物分子(A)电离。

RH⁺ + A --> R + AH⁺（质子转移）

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺（去氢）

R+^. + A --> R + A^+.（电荷交换）

最常见的电离反应是质子化，质子亲和势高于反应气的分子易发生这种电离。去氢反应常见于质子亲和势较低的分子，而电离能较高的反应气易发生电荷交换反应。

待分析物的压力远低于反应气。如果我们将甲烷视为反应气，则电子轰击主要导致甲烷电离并碎裂为CH₃⁺。之后这些离子会在源内的高压环境中发生离子-分子反应。

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

CH₅⁺可充当布朗斯台德酸，C₂H₅⁺充当路易斯酸，使分析物产生离子。

谨慎选择CI反应气体对于电荷向分析物分子转移的过程会有改善作用，因为化学电离气体的气相酸度会影响电荷转移效率。在CI电离中，分析物碎裂程度更小，更倾向于产生分子离子，因此节省了在EI电离中通常被内化用于破坏化学键的能量。

负离子化学电离(NCI)

对于带有电子捕获结构（例如氟原子或硝基苯基团）的分析物，可以采取CI的一种变式 - 负化学电离(NCI)。此方法的灵敏度远超过EI（据报道在某些情况下可高至100到1000倍）。NCI适用于各种经过化学修饰（或可进行化学修饰）以促进电子捕获的小分子。

在负离子电离中，产生负离子的主要机制有两种：电子捕获和反应离子化学电离。在CI条件下，电负性分子可以捕获热电子以产生负离子。负离子化学电离的机制是分析物化合物(AH)与带负电荷的反应离子(R^-.或R^-）反应。这个过程中可能发生几种类型的离子-分子反应，最常见的是去质子化反应。

AH + R^-  --> A^- + RH

反应离子的质子亲和势（碱度）越高，发生去质子化反应的可能性就越大。

气相色谱(GC)

对许多人来说，他们第一次接触到的质谱仪可能是气相色谱系统的检测器。从业者们正不断扩展GC-MS的仪器类型，力求突破早期仪器设计的限制，应对环境分析、食品安全筛查、代谢组学等应用以及法医学、毒理学和药物筛查等临床应用中日益严格的法规要求。

过去，GC-MS分析主要使用两种类型的质谱仪：扇形磁场质谱仪和单四极杆质谱仪。前者分辨率高、可测定准确质量数，适用于需要极高灵敏度的应用。后者用于目标化合物的常规分析。

挑战性很大的GC-MS分析采用扇形磁场仪器：环境/工业样品中的二噁英分析或竞技体育比赛中非法使用体能增强药物的筛查分析。扇形磁场仪器可以在飞克级检测水平轻松实现高分辨率/选择性的分析。

四极杆GC-MS系统一经推出就迅速在靶向分析应用领域得到了认可。美国环保局(USEPA)的方法规定使用四极杆GC-MS仪器来分析样品中的多种环境污染物。因为这些应用只要求达到皮克到纳克级的检测水平，所以尽管四极杆仪器的灵敏度不及扇形磁场仪器，但并不会构成限制。相反，大幅降低的成本、易用性以及便携性给四极杆仪器创造了机会。

液相色谱(LC)

这项革命性的技术让我们得以探索化学世界中大约80%的物质 - 那些GC触及不到的部分，也是近几十年来质谱技术显著进步并日益受到关注的原因。在此我们只列举几位率先将LC与MS相结合的先驱（请参阅“简史”部分）。我们现在所知的LCMS最早诞生于20世纪70年代（尚有争议），并在20世纪90年代初几近成熟。我们今天实际使用的许多设备和技术都直接沿用自那个时代。

液相色谱法最早在1900年代早期由俄罗斯植物学家Mikhail S. Tswett提出。他的研究重点是在一根填充有颗粒的柱子中使用溶剂分离从植物叶片中提取的色素。溶液（流动相或凝聚相）流过填充颗粒床（固定相）时，其中的分析物会争相与颗粒发生相互作用，最简单的液相色谱形式就依赖于高精度预测和重现这种竞争作用的能力。得益于近年来人们开发出的填充各种功能性填料的色谱柱和能够精准输送流动相的溶剂输送系统，LC已成为许多行业的主力分析技术。

“HPLC”这个首字母缩写词由Csaba Horváth在1970年提出，表示该技术需要利用高压使填充柱中产生液相色谱分析所需的液流。从那时起，HPLC仪器的性能不断进步，包括开发更小的颗粒和提升选择性，也见证了首字母缩写向高效液相色谱(high-performance liquid chromatography)的转变。

2004年，仪器和色谱柱技术的进一步发展使液相色谱的分离度、速度和灵敏度显著提高。一种色谱柱填料颗粒更小[1.7 μm]且仪器构造专为在15,000 psi [1,000 bar]下输送流动相而开发的技术开始为人所知，该技术被称为“UPLC”，这个新的术语代表“超高效液相色谱”(ultra-performance liquid chromatography)。这项技术如今的呈现形式大都与John Knox等研究人员在20世纪70年代所预测的一致。Knox预测最佳粒径为1-2 μm并且色谱分离对摩擦热很敏感。在开发适用性广的UPLC技术的过程中，不出所料人们遇到了需要更耐用、颗粒更小且均匀的技术这个挑战，并成功解决了它。阅读有用的基础入门指南，详细了解HPLC和UPLC技术。

电喷雾电离(ESI)

“大气压电离”(API)这个通用术语包括最为人所熟知的电喷雾电离(ESI)技术，该技术是能在大气压而非真空条件下产生离子的各种相关技术的基础。样品溶解在极性溶剂中（溶剂挥发性通常低于GC所用的溶剂），被泵送通过一根施加有2000-4000 V电压的不锈钢毛细管。液体在大气压下离开毛细管并形成气溶胶，从脱溶剂化液滴脱落的离子在静电吸引和真空的共同作用下进入质谱仪。

电势从液体转移到分析物并产生离子的机制至今仍是一个有争议的话题。1968年，Malcolm Dole首次提出了电荷残留机制，他假设液滴所带的电荷在液滴蒸发过程中保持不变。液滴的表面张力最终将无法抵消来自施加于液滴的电荷产生的排斥力，导致液滴“爆炸”，形成许多更小的液滴。液滴会持续发生库仑裂变，直到液滴内只剩一个分析物离子。最终液滴中的溶剂蒸发后，就会形成气相离子。

1976年，Iribarne和Thomson提出了另一种模型 - 离子蒸发机制，他们认为小液滴通过库仑裂变形成，这与Dole模型中的液滴形成方式类似。然而，离子蒸发理论认为，液滴表面的电场足够强，从能量角度来看，这会使溶剂化离子趋于离开液滴表面并直接转移到气相中。

这两种机制有可能实际上是协同工作的：电荷残留机制在离子质量数高于3000 Da时占主导地位，而离子蒸发机制在离子质量数较低时占主导地位（请参阅文献：R Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, 763–772 (2000)）。

来自液相色谱仪的液体以电荷平衡状态进入ESI探头。因此，溶剂离开ESI探头带有净离子电荷。为确保ESI是一种连续技术，必须通过电化学反应使溶液带电，从而使电子转移到充当电极的导电表面。除其他影响外，此过程还可能导致pH值变化。假设正离子模式下，带正电的液滴离开喷雾，电子被电极接受（氧化）。（负离子模式的情况正好与此相反。）电活性电极的表面积、电流大小以及化学物质的性质及其电极电势都会产生影响。

总的来说，ESI是一项高效的技术。然而，不同物质反应活化能和能量的总体差异不尽相同。溶液流速和施加的电流决定了每个液滴的限制。分子之间发生竞争并且目标分析物受到抑制的情况并不少见。

对基本ESI理论的一些扩展已被证实是切实有效的（例如将液体减少到极小体积），以Nanospray技术为例，它可将液流减少至30 nL/min，这在样品量有限的蛋白质和氨基酸研究中尤其有用。

大气压化学电离(APCI)

尽管有关APCI的研究是与ESI相关研究同时期发表的，但直到1985年ESI因Fenn的研究成果得到商业化之后，APCI才开始被广泛应用。

Horning于1973年首次尝试将APCI与各种样品引入技术相结合，用于分析挥发性化合物，其中一种技术就是HPLC。借助APCI的辅助功能，那些难以通过ESI转化为气相离子的分析物（即弱极性和挥发性分析物）也可从凝聚相（或液流）中被引入质谱仪。与ESI不同，APCI通过在加热气流中蒸发引入的液体，将中性分析物转移到气相中。化学电离依赖于带电物质在反应离子与目标分子之间的转移来产生可供质量分析的目标离子。在正离子模式下，最为常见的是目标分子与较小的H⁺离子形成加合物，不过目标分子与盐形成加合物的情况也很常见。例如，如果流动相中含有醋酸铵（一种改性剂，常用于替代挥发性低且离子性强的磷酸盐缓冲液）这种弱酸弱碱盐，可以形成铵加合物(M+NH₄)⁺。在较高的盐浓度下，质子化和氨化离子之间的竞争会降低两者的响应。APCI能够形成的最大离子数远多于ESI，因为它会形成过量的反应离子。液体被推入并通过一根不导电的管子（通常是熔融石英玻璃材质），喷雾气体在这根管子周围流动。由此产生的细小液滴与伸出这根不导电的管子末端之外的一根管子（或探头）的加热内壁碰撞，从而转化为气相。实施这种电离时的线速度远高于通常与电喷雾联用的HPLC或超高效液相色谱(UPLC)的流速。不过，现代仪器具有更强的脱溶剂化能力，提升了所有基于气溶胶的技术的性能。

接下来，通过化学电离将脱溶剂化的分析物分子电离。电离势不是像ESI那样通过液体施加，而是在针尖处以等离子体或电晕的形式施加，液滴将从其中通过。实际上，流动相充当了将电荷转移到分析物的媒介。因此，APCI的早期名称是“溶剂介导的电喷雾”。