Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

Separar, identificar y cuantificar con exactitud los aminoácidos en la investigación, el desarrollo y la comercialización de alimentos, piensos y productos bioterapéuticos es un desafío. Estas aplicaciones tienen en común la necesidad de realizar una hidrólisis adecuada de la muestra, un primer paso importante en el flujo de trabajo para el análisis de aminoácidos enlazados, como péptidos y proteínas. La hidrólisis permite el análisis de los aminoácidos liberados, que pueden separarse mediante métodos cromatográficos de intercambio iónico o de fase inversa.

Dados los desafíos del flujo de trabajo en la preparación de muestras, este documento se ha compilado para proporcionar directrices útiles para la hidrólisis de muestras. El material presente en este documento solo sirve como punto de partida para este proceso. En función del tipo de muestra y su complejidad, es posible que sea necesario modificar los métodos de hidrólisis descritos. Para obtener información adicional o consejos para la resolución de problemas relacionados con la hidrólisis o un procedimiento específico, debe ponerse en contacto con el fabricante del instrumento de hidrólisis o con la agencia correspondiente: la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC). Waters no puede proporcionar orientación sobre tipos de muestras específicos.

Para analizar las muestras hidrolizadas (aminoácidos liberados) por HPLC o UPLC, Waters proporciona muchas soluciones que utilizan la derivatización precolumna para poder analizar los aminoácidos mediante detección óptica. Como esto es una parte integral del flujo de trabajo, se incluyen breves introducciones al método HPLC (AccQ•Tag) de Waters y a la solución de análisis de aminoácidos UPLC (AccQ•Tag Ultra). Este documento no contiene información relacionada con el método de análisis de aminoácidos Pico-Tag (reactivo de derivatización con fenilisotiocianato precolumna) de Waters. Aunque el método Pico-Tag todavía está disponible, los métodos basados en AccQ•Tag ofrecen importantes beneficios de rendimiento y se recomiendan para nuevas aplicaciones.

Nota: Este documento está dedicado a la hidrólisis y el análisis de aminoácidos de proteínas/péptidos purificados, alimentos y piensos . No está destinado específicamente al análisis de aminoácidos en muestras de orina, plasma, productos de nutrición parenteral total o medios de cultivo celular. Para obtener información sobre estas aplicaciones, visite www.waters.com/AAA y www.waters.com/Kairos.

Directrices y recomendaciones generales para el análisis

Dada la naturaleza omnipresente de los aminoácidos en el medio ambiente, la contaminación de fondo puede contribuir fácilmente con 20 pmol o más de algunos aminoácidos al análisis de la muestra deseada, en particular para la serina (Ser) y la glicina (Gly). Esta cantidad puede reducirse si se toman precauciones especiales. Como alternativa, si se hidroliza una cantidad suficiente de muestra para proporcionar un mínimo de 200 pmol por aminoácido, la contribución de la contaminación de fondo se puede limitar a menos del 10 %. Independientemente, para aprovechar la sensibilidad de las técnicas de derivatización y los sistemas cromatográficos modernos, que pueden tener límites de detección de 1 pmol o menos, la limpieza y las buenas técnicas de laboratorio son fundamentales. Las fuentes de contaminación están por todas partes. El material de vidrio sucio, los animales de laboratorio, el polvo en el aire, las huellas dactilares y el talco son factores comunes.

Aunque no existe un sistema perfecto único para mejorar la calidad general de los análisis de aminoácidos de baja concentración, las siguientes consideraciones y prácticas son útiles:

• Pirolizar todos los tubos de hidrólisis de 6 x 50 mm (número de referencia: WAT007571) durante la noche a 500 °C para que el vidrio esté lo más limpio posible. Después de extraer los tubos del horno enfriado, cubrirlos con papel de aluminio (limpiado con acetona) y guardarlos en un lugar cubierto.
• Tener en cuenta la posible introducción de contaminantes de las pipetas, puntas desechables, jeringas y otros accesorios utilizados en el procedimiento.
• Antes de la hidrólisis, realizar todos los pasos de manipulación con guantes limpios sin talco y pinzas limpias. El uso de mascarillas quirúrgicas puede ser adecuado.
• Utilizar en todo momento reactivos nuevos. Cada reactivo puede ser una fuente de contaminación. La mejor práctica es dividir las botellas recién abiertas en recipientes más pequeños y limpios.
• Comprobar la calidad del reactivo semanalmente con derivatizaciones del blanco de control.
• Utilizar siempre que sea posible el procedimiento de hidrólisis en fase de vapor. El HCl impuro puede producir hidrólisis poco fiables. Nuestros resultados más consistentes se han obtenido con HCl a ebullición constante. El HCI concentrado de grado reactivo de alta pureza es probable que no sea tan limpio y contenga niveles significativamente más altos de cloro que el de grado de ebullición constante.
• Analizar el agua y los componentes del tampón para detectar cualquier contribución a la contaminación de fondo como muestras de control. Por ejemplo, el agua bidestilada de laboratorio a menudo aporta niveles inaceptables de aminoácidos. Para obtener la mejor calidad del agua, se recomienda un sistema de purificación (agua de 18,2 mΩ-cm).
• Un blanco de control adecuado para la hidrólisis es un tubo de muestra que se ha tratado exactamente como se trata una muestra. Esto incluye el paso de hidrólisis.