Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

La frase “proteína y péptido” se refiere a una muestra relativamente pura de un biorreactor o un proceso de purificación. Estas muestras incluyen poco o ningún material no proteico adicional. La generación de aminoácidos libres a partir de proteínas intactas o péptidos es un paso esencial en la producción de datos útiles y exactos para el análisis de aminoácidos. Para habilitar esta generación, es necesario descomponer o hidrolizar una proteína o un péptido para obtener sus aminoácidos constituyentes individuales.

En esta sección se presentan los procedimientos básicos para la hidrólisis de péptidos y proteínas en fase de vapor y en fase líquida, y se hace hincapié en las consideraciones preliminares necesarias para un análisis óptimo.

Las subsecciones adicionales cubren los procedimientos de hidrólisis alternativos para el análisis de muestras especiales que contienen aminoácidos que no son compatibles con las técnicas de hidrólisis ácida (HCl) estándar: triptófano y cisteína/cistina.

En esta sección, nos centraremos en la hidrólisis ácida por HCl, que es el método más común utilizado para preparar muestras de aminoácidos. Sin embargo, para que las muestras de proteínas se consideren completamente hidrolizadas —mediante cualquier método—, se deben tener en cuenta varios factores. Los tampones neutralizantes, así como los sólidos presentes, deben considerarse en las estimaciones de procedimiento. Además, la velocidad o el alcance de la hidrólisis varían para los aminoácidos presentes en las proteínas, lo que requiere realizar estudios del efecto del tiempo en el proceso de hidrólisis y la validación adecuada de todos los métodos. La manipulación adecuada de las muestras durante la hidrólisis garantiza la obtención de resultados de alta calidad. Las dificultades más frecuentes en este tipo de análisis suelen estar relacionadas con la aplicación de una técnica inadecuada o descuidada. Para lograr una hidrólisis eficaz con este método, primero es necesario responder cuatro preguntas:

1. ¿Es necesario diluir la muestra?
2. ¿Qué volumen de muestra se va a dispensar en los tubos de hidrólisis?
3. ¿Cuál es el volumen específico de ácido que se debe añadir a los tubos (solo para hidrólisis líquida)?
4. ¿Cuál es la cantidad de patrón interno durante esta etapa (si se utiliza)?

Las siguientes secciones describen las determinaciones necesarias y proporcionan ejemplos de cálculos según corresponda.

2.1.1 Consideraciones preliminares

A menos que la muestra sea limitada, debe haber entre 2 y 25 µg de proteína presente en la hidrólisis para minimizar los efectos de la contaminación. Independientemente del modo de hidrólisis, se recomienda utilizar 20 µg.

• No debe haber exceso de material sólido en la muestra. El material puede interferir con la hidrólisis en fase de vapor.
• Si hay otros sólidos presentes en la muestra junto con la proteína, esos pesos deben añadirse a la proteína en la concentración de sólidos por volumen de ácido.
• La concentración neta de ácido en la hidrólisis debe ser de ~6 N.
• Se recomienda un patrón interno (p. ej., Nva [norvalina]) por encima de los patrones externos.
• El patrón interno se debe añadir antes de la hidrólisis. Puede añadirse durante la preparación de la muestra, si fuese apropiado, o puede añadirse al ácido que después se agrega a los tubos de hidrólisis. Normalmente, se calcula la cantidad de patrón interno para que coincida con la cantidad de patrón utilizada para la calibración.
• Se añade fenol al ácido que se utiliza para la hidrólisis, para que actúe como captador de oxígeno.

2.1.2 Dilución de la muestra (si es necesario) antes de la hidrólisis líquida

• Añadir 10 μL de muestra (diluida o no) como mínimo al tubo de hidrólisis. Un volumen menor aportará una cantidad inaceptable de error debido a la incertidumbre volumétrica.
• En la hidrólisis, también debe haber un exceso de peso de ácido de 10 a 100 veces el de la muestra. Cuando la muestra es demasiado concentrada, es posible que la hidrólisis no se realice correctamente. En estos casos, la muestra debe diluirse. Asegurarse de que haya un exceso en el peso del ácido ∼100 veces sobre la cantidad de sólidos en las hidrólisis líquidas.
• Asegurarse de que haya un exceso molar de 25 veces de ácido sobre los tampones en la muestra. Multiplicar los moles de tampón fosfato por 3, teniendo en cuenta los tres grupos valorables.
• El volumen total para la hidrólisis no debe superar el 50 % de la capacidad total del tubo o del recipiente de hidrólisis. Para tubos de 6 x 50 mm, el volumen máximo recomendado es de 100 µL. Incluir los volúmenes de ácido y de patrón interno en este volumen total final.

Ejemplo de cálculo: determinación del requisito de dilución

Para una proteína de 5 mg/mL en 150 mM de NaCl, se determinará la cantidad de sólidos (incluidas las sales) y el factor de dilución.

El primer paso es determinar la cantidad total de sólidos en la muestra. Esto se puede llevar a cabo multiplicando la concentración de proteína (µg/µL) por la concentración en peso de la sal (concentración x PM) para obtener la cantidad total de sólidos.

El siguiente paso es determinar la dilución necesaria para el valor objetivo de 20 µg de proteína (en 20 µL). Esto se puede hacer multiplicando la cantidad/el volumen deseado por la inversa de la concentración de la muestra. Esto da como resultado una relación de dilución de 1:5 necesaria para la muestra descrita anteriormente.

2.1.3 Volumen de muestra a dispensar en el tubo de hidrólisis

El volumen total recomendado para la hidrólisis es de 100 µL (cuando se utilizan tubos de 6 x 50 mm), con un volumen de muestra de 10 a 20 µL. Este volumen de muestra, diluido o no, depende del tipo de hidrólisis realizada y sigue estas pautas:

• Hidrólisis en fase de vapor: desecar la muestra al vacío como una fina película en el fondo del tubo de hidrólisis.
• Hidrólisis líquida: dispensar el volumen adecuado para hidrolizar al menos 2 µg de proteína en el tubo de hidrólisis o, a partir de una cantidad mayor de muestra (hasta 25 µg de proteína), reconstituir con HCl 0,1 N suficiente para transferir ~0,2 µg de proteína (idealmente en 10 µL) a la hidrólisis.

Nuevamente, es importante tener en cuenta que cuanto menor sea la cantidad de proteína en la alícuota de la muestra, más vulnerable será el análisis a la contaminación.

2.1.4 Volumen de ácido que hay que añadir a la hidrólisis

El volumen de ácido añadido a la hidrólisis es fundamental. Sobre todo, para la hidrólisis en fase líquida. A continuación, se proporcionan las pautas para el volumen de ácido con un ejemplo exhaustivo.

• Hidrólisis en fase vapor:
  • Añadir 200 μL de HCl 6 N con un 0,1 % a un 0,5 % de fenol al fondo del recipiente de hidrólisis. (Si se utiliza una estación de trabajo de hidrólisis comercial, añadir el volumen recomendado por el proveedor. Para obtener información adicional, consultar las Secciones 4 y 5.)
• Hidrólisis en fase líquida (ver ejemplo a continuación):
  • Asegurarse de que la concentración final de ácido sea 6 N, con el fenol añadido.
  • Asegurarse de que el exceso molar de ácido sea suficiente (~25 veces) para neutralizar los tampones.
  • Asegurarse de que el exceso de peso de ácido sobre el total de sólidos sea suficiente (~100 veces). Incluir en este cálculo la matriz de la muestra y otros sólidos junto con la proteína.

Ejemplo de cálculo: determinar el volumen de ácido que se añadirá a una hidrólisis líquida

Siguiendo las pautas anteriores, la cantidad mínima de ácido añadida para una hidrólisis debe superar 25 veces la concentración del tampón y 100 veces el exceso de peso de la muestra. Por lo tanto, para determinar el volumen de ácido necesario, se debe calcular lo siguiente:

1. Cantidad de tampón presente
2. Cantidad de ácido necesaria para la neutralización (25 veces) del tampón en la muestra
3. Convertir la cantidad de ácido en volumen
4. Total de sólidos en la muestra
5. Cantidad mínima de ácido necesaria para proporcionar el valor objetivo de exceso de ácido (100 veces) sobre la muestra
6. Convertir la cantidad de ácido en volumen
7. Cantidad total de ácido necesaria (suma de la neutralización y el exceso)

Para una proteína, esto supone 2,1 mg/mL en Na/K₂PO₄ 2 mM:

La cantidad de tampón en cada tubo se determina multiplicando la concentración molar del tampón por el número de grupos valorables (tres para el tampón de fosfato) y luego ajustando al volumen total de la muestra dispensada, en este caso, 10 µL.

Cada tubo contendrá 60 nmol de solución tampón.

A continuación, se determina el exceso de 25 veces multiplicando la cantidad por 25.

Este número corresponde a los moles de ácido tampón necesarios para lograr una neutralización eficaz.

Los moles de solución tampón necesarios para la neutralización deben convertirse en un volumen de ácido para añadirlos a cada tubo.

Para esta muestra, un volumen de 0,25 µL neutralizará eficazmente el tampón.

Para lograr un exceso de ácido de 100 veces sobre la muestra, se debe determinar la cantidad total de sólidos en la muestra. Los sólidos totales serán la proteína más el tampón más cualquier otro material presente. En este caso, la muestra es una proteína purificada.

Esto se puede determinar multiplicando la concentración de proteína (µg/µL) por la concentración en peso de la sal (concentración x PM) para obtener la cantidad total de sólidos.

Se calcula que el total de sólidos para esta muestra es de 24,9 µg.

Para determinar el exceso de ácido objetivo de 100 veces, se debe multiplicar el total de sólidos por 100.

Por último, convertir el exceso en peso a volumen de HCl 6 M para añadirlo a cada tubo, multiplicando el peso por el peso por mol del ácido por la molaridad del ácido.

En este caso, 11,4 µL de HCl 6 M proporcionarán un exceso de 100 veces de ácido sobre la muestra.

El volumen final de ácido a añadir a cada tubo es la suma de los volúmenes necesarios para neutralizar el tampón de muestra y alcanzar el exceso de 100 veces:

Se necesita un volumen de 11,65 µL de HCl 6 M para garantizar una hidrólisis eficaz. Este volumen se puede redondear a un volumen que pueda transferirse con precisión.

2.1.5 Patrón interno (IS)

El uso de un patrón interno (internal standard [IS]) compensa mejor la variabilidad en la hidrólisis de los aminoácidos individuales de la muestra. La norvalina (Nva) es un patrón interno de uso común.

Cuando se utiliza un patrón interno:

• Se puede preparar y dispensar con la muestra.
• Se puede añadir por separado de la muestra.
• Se puede preparar y dispensar con el ácido.
• Asegurarse de preparar el patrón interno de forma que el volumen de inyección de 1 µL del instrumento suministre la misma cantidad en la columna que la muestra.

Para determinar la cantidad de IS necesaria en la muestra inicial, el cálculo se realiza a partir de la cantidad deseada de IS necesaria en la muestra. Como parte de este cálculo, es importante considerar el paso de derivatización.

Ejemplo de cálculo: determinar la cantidad de patrón interno para una muestra

El IS total se determina, operando en orden inverso, al multiplicar la cantidad de IS necesaria en la muestra final, el factor de dilución de la derivatización y la muestra reconstituida en el tubo de hidrólisis. En este ejemplo, se necesitan 25 pmol de IS en la muestra final derivatizada, y se diluye la muestra 10 veces durante la derivatización y 5 veces antes de la derivatización. Por lo tanto:

Esto indica que necesitamos 1250 pmol de IS en nuestra muestra de hidrólisis.

Dado el PM (mg/mol) y la conversión de µL a mL, podemos ver que necesitamos 0,14 mg de IS añadidos a cada mL de nuestra muestra inicial.

2.1.6 Hidrólisis ácida en fase de vapor

La hidrólisis en fase de vapor se recomienda para muestras de péptidos o proteínas relativamente puras que contengan poco o ningún material particulado. Se considera que es el enfoque más sensible. Se prefiere una estación de trabajo de hidrólisis autónoma y automatizada para este tipo de hidrólisis. El control del vacío, el mantenimiento de la temperatura, las purgas con nitrógeno y el secado de la muestra necesarios en el procedimiento se realizan mejor utilizando un sistema automatizado como la estación de trabajo de hidrólisis Eldex, el cual se describe en la sección 4.

Reactivos:

• HCl 6 N con 1 % de fenol por volumen
• Nitrógeno (grado prepurificado)
• Hielo seco

Nota: Para obtener información adicional sobre los reactivos, consultar el manual de funcionamiento de la estación de trabajo de hidrólisis.

Procedimiento (basado en el uso de una estación de trabajo automatizada):

1. Secar una alícuota que contenga de 0,5 a 20 µg de proteína en un tubo de hidrólisis de 6 x 50 mm.
2. Añadir 200 µL de HCl en ebullición constante que contenga un 0,5 % de fenol al fondo del vial de vacío (consultar las indicaciones a continuación).
3. Sellar el vial al vacío después de tres pasos alternos de vacío y purga con nitrógeno.
4. Hidrolizar a 112 a 116 °C durante 24 horas.
5. Enfriar el vial; eliminar el exceso de HCl del exterior de los tubos limpiando con un paño de laboratorio; secar al vacío.

Indicaciones:

• Utilizar fenol cristalino y colocar un cristal (≈0,5 mg) en el fondo del vial. El cristal es más limpio y más estable que el fenol licuado.
• Pipetear con cuidado la muestra y el patrón interno en el fondo de los tubos; utilizar una jeringa para lograr mayor exactitud y facilidad de administración.
• Se pueden etiquetar los tubos marcándolos con una lima o con un lápiz con punta de diamante.
• Evitar que ingresen gotas de HCl en los tubos. Mantener los tubos en posición vertical en el vial de vacío. Si cuenta con menos de 10 a 12 tubos, añadir tubos de blanco como soporte. Es útil inclinar ligeramente el vial durante el enfriamiento.

Nota: Es común que el HCl presente un color marrón después de la hidrólisis. Se deriva del fenol. El etanol o la acetona funcionan bien para eliminar la decoloración de los viales y las tapas.

PRECAUCIÓN: Los problemas relacionados con la hidrólisis pueden ser difíciles de distinguir de los problemas de la derivatización.

2.1.7 Hidrólisis ácida en fase líquida

La hidrólisis en fase líquida se utiliza cuando las muestras son más complejas. En este caso, hay partículas u otras materias extrañas que pueden interferir con el proceso de la fase de vapor. En general, este enfoque se considera menos sensible; pero, cuando se realiza con cuidado y precisión, puede proporcionar buenos resultados.

• Aparatos y reactivos necesarios para esta metodología:
• Balanza analítica
• Horno o bloque calefactor capaz de mantener la temperatura programada en ± 0,1 °C
• Agitador vórtex
• Pipetas volumétricas
• Micropipetas ajustables
• Tubos de hidrólisis con tapón, se recomiendan los de 6 x 50 mm
• Fuente de nitrógeno para la purga
• HCl 6 N

Procedimiento:

Antes de comenzar:

Pesar las muestras correspondientes a aproximadamente 20 mg de proteína al 0,1 mg más cercano en tubos de hidrólisis o transferir la muestra diluida a los tubos (como se calcula en las Secciones 2.1.3 y 2.1.4). Normalmente, se emplea un volumen total de 10 µL. Mezclar.

1. Añadir con precisión el volumen correcto de patrón interno, calculado en la sección 2.1.5, a los tubos de hidrólisis. Mezclar.
2. Añadir un exceso de HCl 6 N (calculado a partir de la sección 2.1.4, paso 3), mezclar y purgar con nitrógeno durante 30 segundos. Tapar inmediatamente.
3. Colocar en el horno a 110 °C durante 24 horas. (Estos parámetros deben ser el resultado de un estudio del efecto del tiempo para la proteína y los aminoácidos de interés).
4. Retirar del horno y dejar enfriar.
5. La muestra está lista para realizar el paso de derivatización.

2.1.8 Resolución de problemas relacionados con la hidrólisis ácida

Hay varios aminoácidos que se ven afectados por una hidrólisis inadecuada. Por ejemplo:

• La baja producción de metionina (Met) y tirosina (Tyr) suele ser un síntoma de un procedimiento de hidrólisis deficiente, ya sea causado por HCl impuro o por una eliminación inadecuada de oxígeno. Cualquiera de los dos problemas puede provocar la formación de cloro y la posterior cloración de Tyr.
• Los bajos rendimientos para amino ácidos hidrofóbicos (Ile, Leu, Val y otros) pueden indicar una hidrólisis incompleta, causada por una baja temperatura del horno, un tiempo de hidrólisis más corto (especialmente si se está utilizando una hidrólisis rápida a alta temperatura) o una pérdida de HCl resultante de un vacío excesivo después de la purga con nitrógeno (esto puede ser un problema específico de la muestra; algunas secuencias, como lle-Val-Leu, son extremadamente resistentes a la hidrólisis). Verificar que el HCl líquido siga siendo visible en el vial antes de colocarlo en el horno. Demasiada cantidad de HCl también puede ser un problema; el líquido se puede condensar en la muestra y producir un residuo marrón, pérdida de Tyr y Met y la aparición de picos dispersos.
• Si no se está utilizando una estación de trabajo de hidrólisis en fase gaseosa, asegurarse de que la configuración para la hidrólisis sea adecuada. El vial de hidrólisis debe estar completamente tapado en el horno; el uso de un bloque calefactor que encierre solo la mitad inferior del vial provocará la condensación de HCl líquido en la parte superior y la hidrólisis no será efectiva. 

El análisis de Trp en proteínas y péptidos es complicado debido a la inestabilidad de este aminoácido en condiciones normales de hidrólisis con HCl 6 N. Se pueden utilizar procedimientos de hidrólisis alternativos para generar Trp intacto para el análisis:

• Hidrólisis con ácido sulfónico (p. ej., ácidos metanosulfónico y p-toluenosulfónico)
• Hidrólisis básica y uso de reactivos tiol en HCl, como B-mercaptoetanol (BME) o ácido tioglicólico.

2.2.1 Hidrólisis con ácido metanosulfónico (MSA) para el análisis de triptófano

El reactivo MSA debe añadirse directamente a los tubos de muestra de 6 x 50 mm (hidrólisis en fase líquida), ya que el ácido no es volátil. La adición de metanol y la neutralización después de la hidrólisis proporcionan buenos resultados para el triptófano y no interfieren en ningún proceso de derivatización posterior. En la figura 2, se ilustra la reacción del MSA con proteína.

Nota:  Este procedimiento también se puede utilizar para determinar Cys y Met. Convierte Cys a Cya y Met a metionina sulfona.

Nota: Tyr y Trp no son estables en el procedimiento de oxidación con ácido perfórmico utilizado tradicionalmente para el análisis de Cys y Met.

2.2.1.1 Aparatos y reactivos

• MSA 4 M con un 0,2 % (p/v) de triptamina HCl
• Agua ultrapura
• Metanol-agua-trietilamina, 2:2:1
• Tubos de hidrólisis de 6 x 50 mm
• Aparato de secado al vacío
• Baño de agua o bloque calefactor

2.2.1.2 Procedimiento

1. Añadir 20 µL de MSA 4 M que contenga triptamina HCl al 0,2 % (p/v) a cada tubo de muestra de 6 × 50 mm que contenga muestra seca.
2. Añadir 100 µL de agua al vial de reacción.
3. Sellar para hidrólisis.
4. Hidrolizar a 110 °C durante 20 a 24 horas.
5. Enfriar, abrir el vial y añadir 22 µL de KOH 4 M (suficiente para neutralizar) a cada tubo de muestra.
6. Secar al vacío.
7. La muestra está lista para la derivatización.

Indicaciones:

Comprobar si hay interferencias con las muestras de control de blanco.

• Utilizar MSA nuevo y puro.
• Es posible que parte de la interferencia que, en ocasiones, oscurece el Tyr o el Val provenga de la triptamina que se utiliza como aditivo en el ácido comercial. Una solución para esto podría ser usar MSA sin el aditivo.
• Utilizar KOH nuevo (o sustituirlo por NaOH, si el laboratorio lo considera más limpio). Comprobar la capacidad de la base para neutralizar el ácido en una muestra de prueba. Añadir un volumen de base que mantenga el exceso de base al mínimo.
• Preparar un patrón de Trp de 2,5 µmol/mL en H20. Conservar en el congelador. Mezclar el patrón de Trp 1:1 con el patrón H para la calibración.

PRECAUCIÓN:

• Pueden producirse interferencias con Tyr y Val. Se desconoce la causa. (Se prefiere el HCl para la hidrólisis de Tyr.)
• La baja producción de Met es causada por las condiciones de la hidrólisis.
• La producción de Trp y Met son no lineales debido al proceso de hidrólisis, no al procedimiento de análisis. A medida que se reduce la cantidad hidrolizada, disminuye la producción; con Met, el resultado es más marcado.
• Reproducibilidad deficiente de los resultados de Arg: se desconoce la causa.

2.2.2 Hidrólisis alcalina para el análisis de triptófano

Si la hidrólisis ácida del triptófano plantea problemas de estabilidad, otra alternativa es la hidrólisis de la proteína utilizando una base.

• NaOH
• Ácido acético
• Agua ultrapura
• Tubos de hidrólisis de 6 x 50 mm
• Aparato de secado al vacío
• Baño de agua o bloque calefactor

1. Puede ser necesario usar tubos de plástico (por ejemplo, de teflón) para evitar la formación de silicatos y los consiguientes problemas de solubilización o derivatización.
2. Añadir 20 µL de NaOH 4 M recién preparado directamente al tubo de hidrólisis como en el procedimiento de MSA anterior.
3. Sellar el tubo y calentarlo a 112 °C durante 16 horas.
4. Enfriar y neutralizar con exceso de ácido acético.
5. La muestra está lista para la derivatización.
6. Analizar blancos para determinar el nivel de contaminación.
7. Verificar el método en patrones y muestras conocidas.

Es complicado cuantificar la cisteína (Cys) en muestras de proteínas debido a la inestabilidad de este aminoácido en condiciones estándar de hidrólisis ácida. Desafortunadamente, a diferencia del Trp, las hidrólisis ácidas o básicas alternativas no son satisfactorias. Hay dos procedimientos comunes para el análisis de Cys que implican la conversión de la cisteína en derivados más estables. El primer procedimiento es la alquilación del grupo sulfhidrilo, y el segundo es una oxidación al ácido sulfónico, ácido cisteico o cianúrico (Cya) estable frente al ácido.

ADVERTENCIA: Una complicación adicional que se puede presentar durante el análisis de Cys es que gran parte del aminoácido está presente como el dímero, cistina (Cys2), que debe reducirse a cisteína antes de cualquier procedimiento de alquilación.

Es importante tener en cuenta que estos procedimientos específicos se realizan antes del paso de la hidrólisis ácida estándar.

El ácido perfórmico es un potente reactivo oxidante que convierte cuantitativamente la cisteína (Cys) y la cistina (Cys2) en ácido cisteico (Cya) (figura 4). La bibliografía contiene muchas referencias al uso de este reactivo en una amplia variedad de condiciones y procedimientos. El siguiente procedimiento se basa en el de Tarr, G.E., 1986.

Nota: Este procedimiento produce los resultados más exactos para la cisteína y la metionina.

• Aparato de secado al vacío
• Tubos de hidrólisis de 6 x 50 mm con tapón
• Ácido fórmico ultrapuro
• Peróxido de hidrógeno ultrapuro
• Balanza analítica
• Micropipetas

1. Secar al vacío la muestra (0,1 a 10 µg de proteína o 50 a 2000 pmol de péptido) en un tubo de hidrólisis de 6 x 50 mm.
2. Mezclar 19 volúmenes de ácido fórmico al 97 % con 1 volumen de peróxido de hidrógeno; dejar reposar tapado una hora a 22 °C.
3. Añadir 10 µL de este reactivo a la muestra seca, dejar reposar 30 minutos a 22 °C y secar al vacío.
4. Hidrolizar utilizando el procedimiento estándar de HCl 6 M (consultar la sección 1.1).

Nota: El Tyr  no son estables en este procedimiento de oxidación.

Los procedimientos de alquilación son más selectivos que la oxidación con ácido perfórmico y producen pocos o ningún cambio en los otros aminoácidos. Esto los hace más adecuados para el análisis de la proteína completa, así como para otros procedimientos que pueden seguir a la modificación de Cys, como el mapeo de péptidos.

En este método, la alquilación se presenta con 4-vinilpiridina; el procedimiento general descrito a continuación también se puede adaptar para varios agentes alquilantes. En principio, se debe añadir suficiente reactivo reductor a la muestra para convertir la cistina (Cys2) en cisteína (Cys). A continuación, se añade el exceso de reactivo de alquilación a la muestra reducida (figura 5).

• Secador al vacío, fuente de secado de nitrógeno o liofilizador
• Viales resellables
• Balanza analítica
• Medidor de pH
• Micropipetas
• Piridiletilcisteína (PEC) como patrón
• Cloruro de guanidinio (Gu-HCl)
• Ditiotreitol (DTT)
• 4-vinilpiridina (4-VP)
• Acetato de N-etilmorfolinio
• Ácido acético ultrapuro
• Patrón de aminoácidos (número de referencia: WAT088122)

1. Añadir agua a 6,4 mL de N-etilmorfolinio para llevar el volumen a 100 mL.
2. Lograr un valor de pH 8,3 con ácido acético.

El siguiente procedimiento se puede utilizar para 1 a 1000 nmol de proteína o péptido.

1. Colocar la muestra en un vial que se pueda sellar; secar al vacío, con N₂, o con liofilización.
2. Disolver la muestra en 1 mL de solución tampón.
3. Añadir 1 g de Gu-HCl. Mezclar.
4. Añadir 4 mg de DDT. Mezclar.
5. Cubrir la muestra con N₂, sellar herméticamente e incubar a temperatura ambiente durante 4 horas.
6. Añadir 8 µL de 4-VP, cubrir con N₂, sellar e incubar a temperatura ambiente durante 4 a 16 horas.
7. Añadir 3 mL de agua.
8. Desalar.
9. En este punto, la muestra se puede hidrolizar con ácido.

Nota: El volumen total de la reacción se puede disminuir reduciendo el tampón a0,25 mL, el Gu-HCl a 250 mg, el DTT a 1 mg y el 4-VP a 2 µL. Esto es adecuado para hasta250 pmol de muestra. Después de la alquilación, diluir con 750 µL de H₂0 y continuar.

1. Preparar una solución de piridiletilcisteína (PEC) de 2,5 mM.
2. Añadir 200 µL de patrón de aminoácidos a 200 µL.
3. Derivatizar 10 µL de mezcla de calibración de PEC combinada.
4. Reconstituir en 100 µL; inyectar 4 µL para calibrar al nivel de 250 pmol.

Nota: 8 µL de 4-VP equivalen aproximadamente a 74 µmol. Se puede sustituir el 4-VP por otros reactivos alquilantes (p. ej., ácido yodoacético) en el procedimiento utilizando la misma concentración de reactivo.