Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

Los alimentos y los piensos están formados por compuestos químicos que contienen aminoácidos esenciales para el crecimiento y la nutrición. Analizar el contenido de aminoácidos es importante para garantizar una nutrición adecuada. Es necesario recordar que estos productos se producen en procesos a granel. Es así que, al igual que en la producción farmacéutica, los procesos de gran volumen pueden variar en el rendimiento durante un ciclo de producción. Por ello, se debe tener en cuenta lo que constituye una muestra representativa. Por lo general, se debe implementar una estrategia de submuestreo. El análisis de aminoácidos de estos productos requiere diversos enfoques para evaluar la composición de proteínas totales de las muestras de manera adecuada. Debido a que los alimentos y piensos se producen a granel y contienen componentes no proteicos, se recomienda la hidrólisis líquida.

Nota: Los aminoácidos que contienen azufre, cisteína y metionina, y el aminoácido triptófano no son estables en la hidrólisis ácida estándar. Se pueden utilizar metodologías alternativas para analizar estos aminoácidos de manera eficaz.

En esta sección, se presentan tres procedimientos de hidrólisis diferentes:

• Hidrólisis ácida: para determinar el contenido total de proteína y la composición.
• Oxidación con ácido perfórmico: para determinar los aminoácidos que contienen azufre, cisteína y metionina.
• Hidrólisis alcalina: para evaluar la recuperación de triptófano.

Al analizar los aminoácidos unidos en proteínas, se deben romper los enlaces peptídicos para liberar los aminoácidos para el análisis (figura 1). Para hidrolizar las muestras de proteínas del pienso, se debe tener en cuenta el pH del material de la muestra y la presencia de sólidos. Como se mencionó en las secciones anteriores, la velocidad o el grado de hidrólisis varía entre los aminoácidos presentes en las proteínas. Sobre todo, en el caso de las proteínas unidas a los alimentos. Como en cualquier método de hidrólisis, los parámetros seleccionados deben ser el resultado de una cuidadosa experimentación.

Al analizar piensos, se deben tener en cuenta tres factores en la preparación de las muestras:

1. Tratamiento de las muestras
2. Cantidad de muestra hidrolizada
3. Volumen de ácido utilizado para la hidrólisis

3.2.1 Tratamiento de las muestras

Los cereales para piensos y muestras similares no suelen ser uniformes. Para hacerlas lo más uniformes posible, las muestras deben triturarse hasta obtener un polvo fino. Las muestras con alto contenido de grasa se pueden desengrasar mediante procedimientos estándar antes del triturado final. Un polvo fino permite realizar una hidrólisis eficaz de las proteínas del pienso. Para aplicar el método AOAC (4.1.11, 994.12b, J. AOAC Int. 88, 2005, Amino Acid Analysis of Feeds), se requiere que la muestra de prueba se muela hasta que pueda pasar a través de un tamiz de 0,25 mm o malla 60 (tamaño de partícula de 250 µm).

3.2.2 Cantidad de muestra

El método AOAC para el análisis de aminoácidos en piensos recomienda utilizar el siguiente cálculo para determinar la cantidad de muestra utilizada en el análisis de piensos.

Calcular la cantidad aproximada de muestra para el análisis de la siguiente forma:

Ws = 1000/Ns

donde Ns = contenido de nitrógeno de la muestra de ensayo (%) y Ws = peso del material de prueba equivalente a 10 mg de contenido en nitrógeno (mg).

En general, este valor caerá en el intervalo de 100 a 1000 mg del material para cada muestra analizada.

3.2.3 Volumen de ácido

Como se indicó anteriormente, se necesita un gran exceso de peso de ácido para la hidrólisis eficaz de las muestras de proteínas. Los piensos no son diferentes. Sin embargo, a diferencia del exceso de 100 veces analizado en la sección 2.1.2, la relación entre el peso del ácido añadido y el peso de la muestra varía de 50 a 500 veces en el método AOAC 994.12. Este intervalo y la presencia de materiales particulados no proteicos en gran cantidad en los piensos indican la necesidad de un estudio cuidadoso de determinación del intervalo antes del uso de rutina para el análisis de piensos.

3.2.4 Patrones internos

El uso de un patrón interno (internal standard [IS]) compensa mejor la hidrólisis variable de los aminoácidos individuales de la muestra. Waters recomienda utilizar norvalina (Nva) como IS para AccQ•Tag Ultra en UPLC y ácido alfa-aminobutírico (AABA) o norleucina para AccQ•Tag en HPLC. La norleucina es el patrón interno recomendado en el método AOAC 994.12 para el análisis de piensos. Se debe tener cuidado al elegir un IS para garantizar que se puedan lograr las resoluciones deseadas entre los picos de aminoácidos en la cromatografía.

3.2.5 AOAC 994.12: Aminoácidos en piensos

La bibliografía contiene diversos métodos que se pueden adaptar al análisis de aminoácidos en los piensos. El método que se presenta aquí es una adaptación del método 994.12 de la AOAC: Aminoácidos en piensos.

• Balanza analítica, legibilidad ± 0,1 mg
• Balanza, carga superior
• Botella de 50 mL; polietileno
• Tubos de digestión, son adecuados los matraces de ebullición
• Es adecuado el bloque de digestión, la manta calefactora o el baño de agua.
• Unidades de filtro, 0,22 µm (Millex GS, Millipore son adecuadas)
• Medidor de pH, calibrado con soluciones tampón de pH 2,0, 4,0 y 7,0
• Condensador de reflujo
• Rotavapor
• Vasos de vidrio de 250 y 1000 mL
• Matraz Erlenmeyer (150 mL)
• Matraz de evaporación de fondo redondo (1000 mL)
• Probetas graduadas de 100, 500 y 1000 mL
• Matraz aforado (1000 mL)
• Pipetas aforadas de 10 y 20 mL
• Filtro de vidrio sinterizado, porosidad de 10 a 15 µm
• Jeringas

• DL-norleucina, cristales
• Ácido clorhídrico concentrado
• Solución de hidróxido de sodio al 30 % (30 g/100 mL)
• Fenol, cristales
• Solución de tiodiglicol al 98 %
• Citrato de trisódico dihidrato
• Tampones de pH, pH 2,0, 4,0 y 7,0

Tampón de citrato de sodio, pH 2,20

1. Pesar 19,60 g de citrato trisódico dihidratado en un vaso de precipitados de 1000 mL.
2. Disolver en aproximadamente 800 mL de H₂O.
3. Mientras se agita, añadir 10 mL de solución de tiodiglicol al 98 % y 15 mL de HCl.
4. Transferir la solución de manera cuantitativa a un matraz aforado de 1000 mL y diluir hasta la marca con H₂O.
5. Filtrar la solución tampón a través de un filtro de vidrio sinterizado.
6. Ajustar el pH a 2,20 con HCl o NaOH 2 M.

Solución de HCl-fenol 6 M

1. Pesar 1 g de cristales de fenol en un vaso de precipitados tarado de 1000 mL.
2. Disolver los cristales en 500 mL de H₂O. Mientras se agita, añadir lentamente 500 mL de HCl.

Solución de ácido clorhídrico: 1 M

1. Verter aproximadamente 800 mL de H₂O en un matraz aforado de 1000 mL.
2. Añadir 83,3 mL de HCl con una pipeta.
3. Diluir hasta la marca con H₂O y mezclar bien.

Solución de ácido clorhídrico: 0,1 M

1. Verter aproximadamente 800 mL de H₂O en un matraz aforado de 1000 mL.
2. Añadir 100 mL de HCl 1 M con una pipeta.
3. Diluir hasta la marca con H₂O y mezclar bien.

Solución de hidróxido de sodio (NaOH 2 M)

1. Pesar 80,0 g de NaOH en un vaso de precipitados tarado de 1000 mL.
2. Disolver lentamente las lentejas en un vaso de precipitados en 600 mL de H₂O.
3. Enfriar la solución y transferir de manera cuantitativa a un matraz aforado de 1000 mL.
4. Diluir hasta la marca con H₂O y mezclar bien.

Solución de patrón interno

1. Pesar con precisión 195-200 mg de cristales de DL-norleucina en un matraz Erlenmeyer tarado de 150 mL.
2. Disolver con 100 mL de HCl 1 M.
3. Transferir la solución de manera cuantitativa a un matraz aforado de 1000 mL y diluir hasta la marca con H₂O.

1. Pesar con exactitud 100-1000 mg de muestra de ensayo finamente molida con una precisión de 0,1 mg (equivalente a aproximadamente 10 mg de contenido de nitrógeno) en tubos de digestión etiquetados. Utilizar el cálculo descrito en la sección anterior para determinar la cantidad real de muestra que se va a utilizar.
2. Añadir 50 mL de solución de HCl-fenol 6 M a la porción pesada y agitar brevemente. Añadir de 2 a 3 trozos de piedras de ebullición a la solución.
3. En una campana extractora, hidrolizar a reflujo durante 24 h a 110-120 °C utilizando un bloque calefactor o un baño de agua equilibrado a la temperatura.
4. Retirar los tubos de digestión del calor y dejar enfriar a temperatura ambiente.
5. Añadir 20 mL de solución de patrón interno de norleucina a cada solución de prueba con una pipeta aforada. Mezclar las soluciones agitando los matraces.
6. Filtrar los hidrolizados a través de un filtro de vidrio sinterizado en matraces de fondo redondo para rotavapor de 1000 mL etiquetados.
7. Conectar los matraces a los rotavapores y evaporar a 60 °C hasta sequedad.
8. Lavar añadiendo aproximadamente 20 mL de H₂O y repetir la evaporación. Repetir los pasos de lavado y evaporación dos veces.
9. Retirar el matraz del rotavapor.
10. Añadir 50 mL de tampón de citrato de sodio al hidrolizado evaporado, mezclar bien y transferir a una botella de polietileno de 50 mL etiquetada.
11. La muestra está lista para prepararse para la derivatización.

La cisteína y la metionina son aminoácidos críticos en el análisis de piensos; ambos limitan el crecimiento de los animales que consumen pienso. Debido a que las condiciones de la hidrólisis ácida estándar no funcionan para estos aminoácidos específicos, se suele realizar una oxidación alternativa con ácido perfórmico. Este método convierte la cisteína y la cistina en ácido cianúrico y la metionina en metionina sulfona (figura 3). A continuación, las muestras se pueden hidrolizar con ácido y derivatizar de forma eficaz.

En la bibliografía, existen diversas versiones de la oxidación con ácido perfórmico. Aunque los procesos generales son similares, sus características específicas difieren. Esta guía presenta dos procedimientos que se pueden utilizar como posibles puntos de partida. El primer método es del AOAC 994.12. El segundo es un método alternativo basado en MacDonald et al, 1985. Es necesario realizar una evaluación y optimización minuciosas antes de comprometerse con un enfoque específico.

• Balanza analítica, legibilidad ± 0,1 mg
• Equilibrio, carga superior
• Botella de 50 mL; polietileno
• Tubos de digestión, son adecuados los matraces de ebullición
• Es adecuado el bloque de digestión, la manta calefactora o el baño de agua.
• Unidades de filtro, 0,22 µm (Millex GS, Millipore son adecuadas)
• Medidor de pH, calibrado con soluciones tampón de pH 2,0, 4,0 y 7,0
• Condensador de reflujo
• Evaporador rotatorio
• Vasos de vidrio de 250 y 1000 mL
• Matraz Erlenmeyer (150 mL)
• Matraz de evaporación de fondo redondo (1000 mL)
• Probetas graduadas de 100, 500 y 1000 mL
• Matraz aforado (1000 mL)
• Pipetas aforadas de 10 y 20 mL
• Filtro de vidrio sinterizado: porosidad de 10 a 15 µm
• Baño de hielo
• Jeringas

• Ácido fórmico al 88 %
• Peróxido de hidrógeno al 30 %
• Metabisulfito de sodio
• DL-norleucina, cristales
• Ácido clorhídrico concentrado
• Solución de hidróxido de sodio al 30 % (30 g/100 mL)
• Fenol, cristales
• Solución de tiodiglicol al 98 %
• Citrato de trisódico dihidrato
• Tampón de pH, pH 2,0, 4,0 y 7,0

Tampón de citrato de sodio, pH 2,20

1. Pesar 19,60 g de citrato trisódico dihidrato en un vaso de precipitados de 1000 mL.
2. Disolver en aproximadamente 800 mL de H₂O.
3. Mientras se agita, añadir 10 mL de solución de tiodiglicol al 98 % y 15 mL de HCl.
4. Transferir la solución de manera cuantitativa a un matraz aforado de 1000 mL y diluir hasta la marca con H₂O.
5. Filtrar la solución tampón a través de un filtro de vidrio sinterizado.
6. Ajustar el pH a 2,20 con HCl o NaOH 2 M.

Solución de HCl-fenol 6 M

1. Pesar 1 g de cristales de fenol en un vaso de precipitados tarado de 1000 mL.
2. Disolver los cristales en 500 mL de H₂O. Mientras se agita, añadir lentamente 500 mL de HCl.

Solución de ácido clorhídrico: 1 M

1. Verter aproximadamente 800 mL de H₂O en un matraz aforado de 1000 mL.
2. Añadir 83,3 mL de HCl con una pipeta.
3. Diluir hasta la marca con H₂O y mezclar bien.

Solución de ácido clorhídrico: 0,1 M

1. Verter aproximadamente 800 mL de H₂O en un matraz aforado de 1000 mL.
2. Añadir 100 mL de HCl 1 M con una pipeta.
3. Diluir hasta la marca con H₂O y mezclar bien.

Solución de hidróxido de sodio (NaOH 2 M)

1. Pesar 80,0 g de NaOH en un vaso de precipitados tarado de 1000 mL.
2. Disolver lentamente los gránulos en un vaso de precipitados en 600 mL de H₂O.
3. Enfriar la solución y transferir de manera cuantitativa a un matraz aforado de 1000 mL.
4. Diluir hasta la marca con H₂O y mezclar bien.

Solución de patrón interno

1. Pesar con exactitud 195-200 mg de cristales de DL-norleucina en un matraz Erlenmeyer tarado de 150 mL.
2. Disolver con 100 mL de HCl 1 M. Transferir la solución de manera cuantitativa a un matraz aforado de 1000 mL y diluir hasta la marca con H₂O.

Reactivo de ácido perfórmico

1. Preparar en la campana. Pesar 25 mg de cristales de fenol en un tubo de ensayo de 25 mL.
2. Añadir 0,5 mL de H₂O₂ al 30 % con una micropipeta.
3. Añadir 4,5 mL de solución de ácido fórmico al 88 %.
4. Cubrir el tubo de ensayo con un tapón y dejar reposar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Después de 30 minutos, colocar los tubos de ensayo en un baño de hielo y enfriar la mezcla de ácido perfórmico durante 15 minutos.
6. Preparar el reactivo justo antes de usarlo.

1. Pesar con exactitud de 100 a 1000 mg de muestra de prueba finamente molida, con precisión de 0,1 mg (equivalente a unos 10 mg de contenido de nitrógeno) en tubos de hidrólisis etiquetados. Utilizar el cálculo descrito anteriormente para determinar la cantidad real de muestra que se va a utilizar.
2. Colocar un agitador magnético en cada tubo y colocar los tubos de digestión en un baño de hielo (0 °C).
3. Después de que el ácido perfórmico y la muestra se hayan enfriado durante al menos 15 minutos, añadir 5 mL de reactivo de ácido perfórmico en cada tubo de digestión; usar un tapón o una tapa para todos los tubos y agitar durante 15 minutos.
4. Volver a colocar los tubos de digestión en el baño de hielo y dejar que las muestras se oxiden durante 16 horas.
5. Quitar los tapones de vidrio y añadir aproximadamente 0,84 g de metabisulfito de sodio para descomponer el ácido perfórmico. Agitar durante 15 minutos para liberar el S_O2.
6. La muestra está ahora lista para la etapa de hidrólisis ácida.

1. Añadir 50 mL de solución de HCl-fenol 6 N a la porción pesada y agitar por poco tiempo. Añadir de 2 a 3 trozos de piedras de ebullición a la solución.
2. En una campana extractora, hidrolizar a reflujo durante 24 horas a 110-120 °C utilizando un bloque calefactor o un baño de agua equilibrado a la temperatura.
3. Retirar los tubos de digestión del fuego y dejar enfriar a temperatura ambiente.
4. Añadir 20 mL de solución de patrón interno de norleucina a cada solución de prueba con una pipeta aforada. Mezclar las soluciones agitando los matraces.
5. Continuar con los pasos (a – d) o (e – g) a continuación.
   1. Filtrar los hidrolizados a través de un filtro de vidrio sinterizado en matraces de evaporación de fondo redondo de 1000 mL etiquetados.
   2. Conectar los matraces a los rotavapores y evaporar al vacío a 40 °C hasta que queden aproximadamente 0,5 mL. Nota: No dejar que la solución se evapore hasta la sequedad.
   3. Retirar el matraz del evaporador.
   4. Añadir 50 mL de tampón de citrato de sodio al hidrolizado evaporado, mezclar bien y transferir a una botella de polietileno de 50 mL etiquetada.
   5. Filtrar los hidrolizados en un matraz para filtración con vacío de 250 mL a través de un filtro de vidrio sinterizado y después transferir el filtrado a un vaso de precipitados de 250 mL.
   6. Colocar el vaso de precipitados en un baño de hielo.
   7. Neutralizar parcialmente los hidrolizados con aproximadamente 40 mL de NaOH 7,5 M, mientras se agita. (Nota: La temperatura no puede superar los 40 °C.) Ajustar el pH a 2,2 con NaOH 2 M.

     6. La muestra está lista para prepararse para la derivatización.

Nota: La bibliografía contiene muchas referencias diferentes para este ensayo. No hay acuerdos sobre la cantidad de ácido perfórmico y bromuro de hidrógeno o la temperatura de evaporación. Cambiar la cantidad o la temperatura afectará al tiempo de evaporación en el paso 7.

• Tubos de 25 x 150 mm con tapón
• Hielo y baño de hielo
• Pipetas aforadas
• Evaporador al vacío
• Fuente de nitrógeno limpia
• Horno o bloque calefactor
• Material de vidrio aforado
• Ácido perfórmico
• Peróxido de hidrógeno
• Ácido fórmico
• Agua ultrapura
• Solución de HBr al 48 % en peso

1. Añadir un volumen de peróxido de hidrógeno al 30 % a nueve volúmenes de ácido fórmico al 88 %.
2. Dejar reposar la mezcla durante una hora, agitándola con frecuencia.
3. Colocar la mezcla en un baño de hielo durante 30 minutos y después utilizarla de inmediato.

1. Pesar las muestras correspondientes a aproximadamente 20 mg de proteína (al mg más próximo) en tubos de 25 x 150 mm.
2. Colocar las muestras en un baño de hielo durante 30 minutos.
3. Añadir 10 mL de ácido perfórmico frío a las muestras, agitarlas suavemente y taparlas con un tapón recubierto de teflón.
4. Conservar las muestras (todavía en abundante hielo) a 0 °C durante la noche (16 horas) en la nevera.
5. Después de 16 horas, con las muestras todavía a 0 °C, añadir 3 gotas de octanol y 3 mL de HBr refrigerado al 48 %, agitando las muestras lentamente. Realizar este paso en una campana. Dejar reposar las muestras a 0 °C durante 30 minutos.
6. Evaporar hasta la sequedad con un evaporador al vacío a 37 °C. Esto llevará de 1 a 2 horas.
7. Añadir 5 mL de HCl 6 N a los tubos. Purgar con nitrógeno durante 30 segundos y tapar inmediatamente.
8. Colocar las muestras en un horno a 110 °C durante 24 horas.
9. Retirarlas del horno y dejar enfriar.
10. Añadir 10 mL de patrón interno de trabajo, 5,0 µmol/mL, y mezclar bien. Nota: La concentración real del patrón interno se debe calcular para proporcionar la misma cantidad de inyección en el instrumento. 
11. Transferir de manera cuantitativa las muestras a matraces aforados de 250 mL, enjuagar los tubos de muestra con agua de calidad HPLC y llenar los matraces hasta la marca con los lavados.
12. Filtrar aproximadamente 1 mL de las muestras del paso 12 a través de un filtro para muestras de 0,45 µm. Si no se derivatiza de inmediato, almacenar las muestras tapadas en un congelador. Nota: Este paso de filtración se puede sustituir por la centrifugación. Centrifugar para obtener un sobrenadante transparente.

En las condiciones estándar de hidrólisis ácida, el triptófano (Trp) es inestable y no se puede analizar de forma eficaz. Se propone la hidrólisis básica como método alternativo para la liberación y análisis de este aminoácido en piensos. Este método utiliza NaOH 4,2 M para hidrolizar la proteína. Una ventaja de este método es que una vez finalizado no se requiere la derivatización. Todo lo que se requiere es un análisis instrumental con detección UV a 280 nm.

El procedimiento que se presenta aquí está adaptado del método AOAC 988.15: Triptófano en alimentos e ingredientes de alimentos y piensos.

• Matraces Micro Kjeldahl modificados (disponibles en Ace Glass, Inc.): matraces Micro Kjeldahl de 25 mL con un diámetro interno de 12 mm y cuello largo de 15 cm. El cuello se contrae a unos 6 mm de diámetro interno, 5 cm por encima del bulbo del matraz.
• Bomba de vacío
• Aparato de filtración de membrana y filtros de 0,45 µm
• Hielo seco
• Baño de agua
• Etanol para baño de agua
• Pipetas y material de vidrio aforados
• Medidor de pH

• Agua purificada por el sistema Milli-Q (Millipore Corp.) o equivalente
• 4.2 M NaOH
• 1-octanol
• Solución tampón de citrato de sodio a pH 4,25
• HCl
• Solución patrón de triptófano
  • Solución de stock: 1 mg/mL. Disolver 250 mg de L-triptófano en 100 mL de H₂O con seis gotas de HCl. Diluir a 250 mL con H₂O.
  • Solución de trabajo I: 0,1 mg/mL. Diluir 10 mL de solución de stock a 100 mL con H₂O.
  • Solución de trabajo II: 0,04 mg/mL. Diluir 4 mL de solución de stock a 100 mL con H₂O.
  • Refrigerar las soluciones de patrón cuando no se utilicen. Preparar soluciones nuevas una vez al mes.

1. Triturar la muestra de laboratorio en un molino centrífugo equipado con un tamiz de 1 mm; mezclar bien.
2. Pesar una porción de prueba que contiene 100 mg de proteína en un matraz Micro Kjeldahl modificado.
3. Para muestras de prueba con >5 % de lípidos:
   1. Añadir 10 mL de éter de petróleo a la muestra pesada en el matraz.
   2. Remover suavemente para mezclar y sonicar durante 20 minutos. Dejar reposar. Centrifugar, de ser necesario.
   3. Extraer la mayor cantidad posible de éter de petróleo, con cuidado para no eliminar ningún sólido.
   4. Evaporar el éter de petróleo restante bajo una corriente suave de N₂. Pasar a la hidrólisis.
4. Para muestras de prueba con <5 % de lípidos: pasar a la hidrólisis.

1. Eliminar el aire de la solución de NaOH 4,2 M burbujeando con N₂ durante 10 minutos.
2. Añadir 10 mL de NaOH 4,2 M sin aire a cada matraz.
3. Añadir tres gotas de 1-octanol.
4. Congelar inmediatamente la solución tratada en un baño de hielo seco/alcohol etílico. A continuación, retirar el matraz del baño y aplicar vacío a 10 mm Hg.
5. Apagar el vacío y sellar los matraces.
6. Colocar el matraz sellado en un vaso de precipitados que contenga H₂O a temperatura ambiente hasta que la solución de prueba se derrita.
7. Colocar el matraz en un horno a 110 °C durante 20 horas.
8. Dejar que los matraces se enfríen a temperatura ambiente.
9. Enjuagar el cuello del matraz con 1 mL de solución tampón de citrato de sodio a pH 4,25, recogiendo el enjuague en un vaso de precipitados.
10. Transferir de manera cuantitativa el hidrolizado al mismo vaso de precipitados de 50 mL, enjuagando el matraz con dos porciones de solución tampón de citrato de sodio a pH 4,25.
11. Neutralizar la solución con 3,5 mL de HCl y agitar enérgicamente. Ajustar el pH a 4,25 ± 0,05.
12. Transferir la solución de manera cuantitativa a un matraz aforado de 25 mL y diluir a volumen con H₂O.
13. Verter la solución en un tubo de centrífuga de 40 mL y centrifugar durante 20 minutos a 1150 G.
14. Filtrar el sobrenadante a través de papel de filtro de vidrio (Whatman GF/A).
15. Transferir el filtrado a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 10 minutos a 23 000 G.

Nota: En este punto se puede tomar una alícuota del sobrenadante para el análisis UV (289 nm), sin derivatización.