Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

Como se indicó anteriormente, existen varios equipos que ayudan específicamente en la hidrólisis de las muestras. Independientemente de los instrumentos, suele haber tres protocolos de hidrólisis diferentes: hidrólisis ácida, que se utiliza para determinar la composición de la proteína total; la hidrólisis ácida después de la oxidación con ácido perfórmico, necesaria para medir los aminoácidos que contienen azufre, como la cisteína y la metionina; y la hidrólisis alcalina, que se utiliza para evaluar la recuperación de triptófano. Si bien el equipo tradicional para la hidrólisis de muestras a menudo implica un proceso que requiere mucho tiempo, los instrumentos para la hidrólisis por microondas pueden acelerar significativamente el proceso. La implementación de la hidrólisis por microondas para los tres protocolos mejora el control de las condiciones de la hidrólisis aportando una mayor exactitud, reproducibilidad, velocidad y robustez.

A través de la tecnología de microondas, el sistema de reacción por microondas CEM Discover SP (CEM Corporation 3100 Smith Farm Road Matthews, NC 28104) (Figura 7) puede hidrolizar proteínas y péptidos como preparación para el análisis de aminoácidos en solo 15 minutos. Como se ilustra en la Figura 8, la aplicación directa de energía de microondas y el uso de sensores de temperatura infrarrojos integrados permiten un calentamiento rápido y el mantenimiento de la temperatura establecida para cada muestra. La posibilidad de agitar la muestra in situ asegura una distribución uniforme del calor a través de la misma y el enfriamiento posterior a la reacción reduce la temperatura de la muestra en segundos.

La siguiente sección describe la configuración y el funcionamiento del sistema. Para obtener más información, póngase en contacto con CEM Corporation o consulte el manual del sistema.

• El sistema tiene un requisito eléctrico de 110 a 140 VCA, 60 Hz, 10 A a 120 VCA.
• El sistema requiere ventilación.
• El sistema requiere un mínimo de 25 psi y un máximo de 60 psi de aire comprimido o nitrógeno comprimido.
• El sistema requiere un equipo informático portátil (proporcionado por CEM) ubicado a menos de tres metros (10 pies) del mismo.

• HCl 6 N para la hidrólisis ácida, 1:1 HCl concentrado:agua desionizada.
• NaOH 4 N para la hidrólisis básica, disolver 16 g de NaOH sólido en 100 mL de agua desionizada.
• Ácido fórmico (solo preoxidación), 9:1 ácido fórmico:peróxido de hidrógeno al 30 %.
• Vial de 10 o 35 mL para Discover SP con barra de agitación y tapa.
• Cristales de fenol

Opción 1

1. Pesar 50 a 500 mg de muestra en un vial de 35 mL con barra de agitación.
2. Colocar los tubos de digestión en un baño de hielo durante alrededor de 15 minutos.
3. Después de enfriar, añadir 5 mL de ácido perfórmico.
4. Cubrir los tubos con tapones de vidrio y agitar en una placa de agitación magnética a baja velocidad durante 15 minutos.
5. Volver a colocar los tubos de digestión en el baño de hielo y dejar que se oxiden durante 16 horas.
6. Quitar los tapones de vidrio y añadir 0,84 g de metabisulfito de sodio para descomponer el ácido perfórmico.
7. Realizar la hidrólisis ácida a partir del paso 2 de la opción 1 en la sección 5.4.2, Hidrólisis ácida

Opción 2

1. Pesar 50 a 500 mg de muestra en un vial de 35 mL con barra de agitación.
2. Añadir 6 mL de solución de ácido perfórmico recién preparada (9:1 ácido fórmico:peróxido de hidrógeno al 30%).
3. Incubar la mezcla de reacción en un baño de agua a 50 ° C durante una hora.
4. Evaporar la solución de ácido perfórmico residual hasta lograr sequedad en un evaporador a 50 ° C.
5. Realizar la hidrólisis ácida a partir del paso 2 de la opción 1 en la sección 5.4.2, Hidrólisis ácida

Opción 1: muestra de 50 a 300 mg

1. Pesar la muestra en un vial de 35 mL con barra de agitación.
2. Añadir un 3 % en peso de fenol.
3. Añadir 5 mL de HCl 6 N.
4. Tapar el vial.
5. Con Dynamic Method Control (Control de método dinámico), programar un método con 300 W, tiempo de permanencia de 15 minutos, 195 °C y 300 psi. La agitación debe estar establecida en el nivel High (Alto).
6. Colocar el vial en la cavidad de Discover y pulsar la tecla Start (Iniciar) para comenzar el método.
7. La muestra debe calentarse a 195 ° C, a no más de 250 psi (± 10 %).

Opción 2: Muestra de 300 a 500 mg

1. Pesar la muestra en un vial de 35 mL con barra de agitación.
2. Añadir un 3 % en peso de fenol.
3. Añadir 10 mL de HCl 6 N.
4. Tapar el vial.
5. Con Dynamic Method Control (Control de método dinámico), programar un método con 300 W, retención de 15 minutos, 195 °C y 300 psi. La agitación debe estar establecida en el nivel alto.
6. Colocar el vial en la cavidad de Discover y pulsar la tecla Start (Iniciar) para comenzar el método.
7. La muestra debe calentarse a 195 ° C, a no más de 250 psi (± 10 %).

Opción 1: muestra de 50 a 300 mg

1. Pesar la muestra en un vial de 35 mL con barra de agitación.
2. Añadir 5 mL de NaOH 4 N.
3. Tapar el vial.
4. Con Dynamic Method Control (Control de método dinámico), programar un método con 300 W, retención de 15 minutos, 195 °C y 300 psi. La agitación debe estar establecida en el nivel alto.
5. Colocar el vial en la cavidad de Discover y pulsar la tecla Start (Iniciar) para comenzar el método.
6. La muestra debe calentarse a 195 ° C, a no más de 250 psi (± 10 %).

Opción 2: Muestra de 300 a 500 mg

1. Pesar la muestra en un vial de 35 mL con barra de agitación.
2. Añadir 10 mL de NaOH 4 N.
3. Tapar el vial.
4. Con Dynamic Method Control (Control de método dinámico), programar un método con 300 W, retención de 15 minutos, 195 °C y 300 psi. La agitación debe estar establecida en el nivel alto.
5. Colocar el vial en la cavidad de Discover y pulsar la tecla Start (Iniciar) para comenzar el método.
6. La muestra debe calentarse a 195 ° C, a no más de 250 psi (± 10 %).

Los ajustes de la temperatura, el tiempo y la potencia dependen de los tipos de muestras que se estén hidrolizando. Es importante mantener el microondas funcionando durante todo el procedimiento. Esto puede requerir algo de experimentación por parte del usuario con objeto de optimizar mejor la preparación de muestras al utilizar esta técnica.

Se recomienda utilizar muestra de tamaño y volumen correctos y recipientes adecuados en los procedimientos descritos anteriormente. Estos factores son fundamentales para el éxito de la hidrólisis. Algunos componentes de la muestra permanecerán en la fase sólida después de la hidrólisis y, por lo general, se volverán de color negro durante el proceso, como se muestra en la Figura 9. Esto es normal; los aminoácidos estarán presentes en la solución. Todas las preguntas relacionadas con el uso del equipo CEM deben dirigirse a CEM Corporation a través de molecular.support@cem.com o llame al 1-704-821-7015 y diríjase al equipo CEM Molecular Sample Preparation Team.