液相層析初學者指南

圖H中，三種染料化合物分別以層析圖中三個時間點的波峰來表示。每種化合物會在特定位置洗脫，依據進樣時[零時]和最大波峰洗脫時之間的經過時間來量測。將每個波峰的滯留時間[t_R]拿來對照同一層析系統[相同的移動相和固定相]中進樣的參比標準品，層析分離人員即可鑑定每種化合物。

圖I-1所示的層析圖讓層析分離人員知道，在這些LC系統條件下，分析物丙烯醯胺將於2.85分鐘[滯留時間]時從管柱中分離和洗脫出來。每當含有丙烯醯胺的新樣品在相同條件下進樣至LC系統時，就會在2.85分鐘處出現一個波峰[請見圖I-2中的樣品B]。

[如需深入瞭解為何某些化合物的移動速度比其他化合物慢[滯留性更好]，請查看HPLC分離模式]。

完成鑑定之後，下一個重要資訊就是樣品中每種化合物的含量。偵測器的層析圖和相關數據有助於我們計算每種化合物的濃度。當化合物譜帶通過流體槽時，偵測器基本上會反應到其中的濃度。濃度越高，訊號就越強；視為高出基線的峰高更多。

圖I-2顯示了樣品A和B在同一時間刻度上疊在一起的層析圖。兩個樣品的進樣體積相同。兩張層析圖均在2.85分鐘的滯留時間[t_R]處顯示一個波峰，表示每個樣品都含有丙烯醯胺。但樣品A的丙烯醯胺波峰更大。峰下面積[峰面積計數]即代表化合物濃度的量測值。面積值由電腦數據站自動積分並計算。在本例中，樣品A中丙烯醯胺的波峰面積是樣品B波峰面積的10倍。使用參比標準品，可以確定樣品A含有10皮克丙烯醯胺，是樣品B的10倍[1皮克]。請注意，兩個樣品中都有另一個波峰[未鑑定]在1.8分鐘時洗脫。由於這個波峰在兩個樣品中的面積計數大致相同，因此該未知化合物在兩個樣品中的濃度可能相同。

等度和梯度LC系統運作

HPLC中使用兩種基本洗脫模式。第一種稱為等度洗脫。在此模式下，移動相（純溶劑或混合物）在整個運作過程中保持不變。圖J-1概述了一個典型系統。

第二種稱為梯度洗脫，顧名思義，移動相組成會在分離過程中發生變化。這種模式適用於樣品所含化合物擁有多種層析分離極性的情形[請見〈HPLC分離模式〉一節]。隨著分離處理繼續進行，移動相的洗脫強度逐漸增加，以洗脫滯留性更強的樣品成分。

最簡單的情況如圖J-2所示，有兩瓶溶劑和兩個幫浦。每個幫浦的速度由梯度控制器管控，負責在分離處理過程中增加或減少各種溶劑的輸送。兩股流液於混合器中混合，形成實際的移動相組成，再輸送到管柱。一開始，移動相含有較高比例的較弱溶劑[溶劑A]。慢慢地，根據預定的時間表，較強溶劑[溶劑B]的比例有所增加。請注意，在圖J-2中，混合器位於幫浦下游；因此梯度是在高壓下產生的。其他HPLC系統的設計則是在低壓下於單個幫浦之前混合多股溶劑流液。梯度比例閥可從四個溶劑瓶中選擇溶劑，並隨時間改變移動相的強度[請見圖J-3]。

HPLC規格[分析、製備和處理]

我們已經討論HPLC如何提供分析數據用於鑑定和定量樣品中所含的化合物。不過，HPLC也可使用偵測器流體槽下游的餾分收集器，來純化和收集每種化合物的所需量。這個過程稱為製備級層析分離[請見圖K]。

在製備級層析分離中，科學家能收集從管柱中洗脫出來的單個分析物[例如在本例中：黃色，接著紅色，然後藍色]。

餾分收集器會在一段指定時間內選擇性地收集現在含有純化分析物的洗脫液。可移動收集瓶，以便每次只收集一個波峰的分析物。

科學家會決定純化程度等級和數量的目標。然後考量樣品複雜度，以及所需分析物相對於基質成分的性質和濃度，最後用這些目標來決定需要處理的樣品量以及HPLC系統所需的容量。一般來說，隨著樣品量增加，HPLC管柱尺寸會變大，幫浦需要的體積流速容量也會越高。決定HPLC系統容量這件事，稱為選擇HPLC規格。表A列出了各種HPLC規格及其層析分離目標。

使用HPLC固定相和移動相的特定組合發揮最大選擇性，使兩種感興趣的樣品成分達到最大可能的分離，這種能力對於決定分離處理升級需求很重要[請參閱有關HPLC分離模式的討論]。然後，容量就會變成調整管柱體積[V_c]以匹配待進樣之樣品量並選擇合適粒徑大小[決定壓力和效率；請參閱有關分離能力的討論]的關鍵。管柱體積是層床長度[L]和內徑[i.d.]的函數，決定了所含填充材料[顆粒]的量（請見圖L）。

通常，HPLC管柱的長度[L]在20 mm~500 mm範圍內，內徑[i.d.]在1 mm~100 mm範圍內。隨著層析分離規格增加，管柱尺寸也會增加，尤其是橫截面積。為了發揮最大通量，移動相流速必須與橫截面積成比例增加。如果要用較小的顆粒獲得更大的分離能力，必須將幫浦設計成能在高背壓下承受更高的移動相體積流速。表B提供了一些簡單指南，說明如何針對每種規格的層析分離建議，選擇管柱內徑和粒徑大小範圍。

例如，半製備級應用[紅色X]使用內徑為10–40 mm，填充5-15微米顆粒的管柱。然後根據每次運作期間需要處理多少純化化合物，以及需要多少分離能力來計算柱長。