液相層析初學者指南

通常，化合物有三種主要特性可以用來產生HPLC分離。分別是：

• 極性
• 電荷
• 分子大小

先瞭解極性和利用此特性的兩種主要分離模式：正相層析和逆相層析。

基於極性的分離

分子的結構、活性和物理化學特性取決於其組成原子的排列和彼此之間的鍵結。在分子內，負責特殊性質和可預測化學反應的某些原子之特定排列稱為官能基。這種結構通常會決定分子是極性還是非極性。有機分子會根據所含有的主要官能基進行分類。使用基於極性的分離模式，不同種類分子的相對層析滯留性大多取決於這些官能基的性質和位置。如圖P所示，不同種類的分子可依據相對滯留性排序，形成從強極性到非極性的層析分離極性範圍或譜圖。

水[一種具有強偶極矩的小分子]是一種極性化合物。苯[一種芳香烴]是一種非極性化合物。具有相似層析分離極性的分子往往會相互吸引，具有不同極性的分子則吸引力較弱，甚至可能會相互排斥。這就是基於極性的層析分離模式的基礎。

也可以使用類比法解釋這種模式，即油[非極性]和水[極性]不會混溶。這與異極相互吸引的磁性不同，基於極性的層析分離取決於同類之間較強的吸引力和異類之間較弱的吸引力。請記住，基於極性的層析分離為「同類相吸」。

為了設計層析分離系統[請見圖Q]，我們選擇具有不同極性的移動相和固定相，讓樣品中所含的各種化合物彼此競爭。然後，樣品中與固定相[管柱填充材料]極性相似的化合物會有所延遲，因為它們受到顆粒強烈吸引。與移動相極性類似的化合物會優先受到移動相吸引，移動得更快。

這樣一來，由於固定相與移動相對每種化合物的相對吸引力不同，分析物的速度會有所變化，藉此產生分離。

圖R-1、R-2和R-3分別顯示了移動相、固定相和樣品分析物的典型層析分離極性範圍。請一個個來看，瞭解層析分離人員如何選擇合適的固定相與移動相來形成吸引力競爭，實現基於的HPLC分離。

標度如圖R-1所示，一些常用溶劑按相對層析分離極性排列，稱為洗脫序。移動相分子會與分析物分子有效競爭有吸引力的固定相位點，取代這些分析物，使其更快通過管柱[滯留性弱]。水處於移動相溶劑標度的極性端，而脂肪烴己烷則處於非極性端。在這兩者之間，可以按照洗脫強度的順序排列單一溶劑和可溶溶劑混合物[以符合特定分離要求的比例混合]。標度哪一端代表「最強」移動相，取決於分析物分子發生競爭的固定相表面性質。

矽膠具有活性、親水性[親水]表面，含有酸性矽烷醇[含矽的醇類似物]官能基。因此落於圖R-2所示固定相標度的極性端。矽膠表面的活性或極性可以透過化學鍵結到極性較弱的官能基[鍵結相]選擇性地改變。此處顯示的範例包括，矽膠上的氰基丙基甲矽烷基-[CN]、正辛基甲矽烷基-[C₈]和正十八烷基甲矽烷基-[C₁₈，ODS]部分，按極性遞減順序排列。後者是一種疏水性[防水]、非極性的填料。

圖R-3重複了樣品的層析分離極性譜圖[如圖P所示]。考慮固定相和移動相的極性之後，對於指定的固定相，層析分離人員必須選擇一種能滯留目標分析物的移動相，但不能滯留到無法洗脫。在強度相似的溶劑中，層析分離人員會考慮哪種相組合可以充分展現分析物極性和溶解度更細微的差異，讓層析分離系統發揮最大的選擇性。雖然說同類相吸，不過從目前的討論中不難看出，基於極性來形成分離這件事，需要非常瞭解樣品，還要擁有關於各種分析物和滯留模式的經驗。總而言之，層析分離人員要選出具有適當相反極性的最佳移動相和顆粒固定相組合。然後，隨著樣品分析物在管柱中移動，同類相吸法則會決定哪些分析物速度減慢，哪些分析物加速前進。

正相HPLC

在植物萃取物的分離中，Tswett成功使用極性固定相[玻璃管柱中的白堊；請見圖A]來搭配極性低許多的[非極性]移動相。這種典型的層析分離模式稱為正相層析。

圖S-1表示三染料檢驗混合物的正相層析分離。固定相為極性，因此對極性黃色染料的滯留性最強。相對非極性的藍色染料會因為非極性溶劑移動相而在滯留競爭中勝出，洗脫速度很快。由於藍色染料最像移動相[兩者都是非極性]，所以移動得更快。對矽膠正相層析來說，移動相一般使用100%有機溶劑，不使用水。

逆相HPLC

逆相一詞是指與正相恰好相反的層析分離模式，即使用極性移動相和非極性[疏水]固定相。圖S-2說明了使用這種實驗步驟分離黑色的三染料混合物的過程。

現在，滯留性最強的化合物是非極性藍色染料，因為它對非極性固定相的吸引力最大。極性黃色染料的滯留性很弱，會因為極性、水性移動相而在滯留競爭中勝出，在層床中移動速度最快，因同類相吸而最早洗脫出來。

如今，由於再現性更高，適用性更廣，約有75%的HPLC方法都使用逆相層析。大多數這些實驗步驟使用水與可溶的極性有機溶劑（如乙腈或甲醇）的水性混合物作為移動相。這樣做通常能確保分析物與非極性疏水顆粒表面產生適當的交互作用。C₁₈鍵結矽膠[有時稱為ODS]是最受歡迎的逆相HPLC填料類型。

表C總結了基於極性的兩種主要HPLC分離模式的固定相和移動相特性。請記住，這些基於極性的模式就是同類相吸。

親水作用層析[HILIC]

HILIC可視為正相層析的另一種形式。在正相層析中，移動相是100%有機溶劑，僅有微量水存在於移動相和極性填料顆粒的孔隙中。極性分析物與極性固定相緊密鍵合，不會洗脫出來。

向有機移動相[通常是一種非質子溶劑，如乙腈]中加入一些水[<20%]，即可分離和洗脫在正相模式中滯留性強的極性化合物[或在逆相模式中滯留性弱的極性化合物]。水是一種極性很強的溶劑，可以有效與極性分析物競爭固定相。HILIC可以在等度或梯度洗脫模式下運作。隨著移動相的極性[強度]增加[因為加了更多水]，最初受到極性填料顆粒吸引的極性化合物就能洗脫出來。分析物會按親水性[相對於水的層析分離極性]遞增的順序洗脫。可以向移動相中加入緩衝液或鹽，讓可離子化的分析物保持單一形式。

疏水作用層析[HIC]

HIC是一種逆相層析，用於分離生物大分子，例如蛋白質。這些分子通常需要在水溶液中保持完整，避免與可能使其變性的有機溶劑或表面接觸。HIC運用大分子與中等疏水性固定相的疏水作用，例如丁基鍵結[C₄]，而不是矽膠的十八烷基鍵結[C₁₈]。一開始，水中較高的鹽濃高會促使蛋白質滯留[鹽析]在填料上。梯度分離通常是逐漸降低鹽濃度來運作。這樣一來，生物分子會按照疏水性遞增的順序洗脫出來。

基於電荷的分離：離子交換層析[IEC]

在基於極性的分離中，同類會受到同類吸引，異類則可能會互斥。在離子交換層析和其他基於電荷的分離中，規則是相反的。同類可能會互斥，而異類則會相互吸引。用於離子交換分離的固定相，其特性在於表面酸性或鹼性官能基的性質和強度，以及吸引和滯留的離子類型。陽離子交換用於在負表面上滯留和分離帶正電荷的離子。相反地，陰離子交換用於在正表面上滯留和分離帶負電荷的離子[請見圖T]。每一種離子交換至少都有兩種通用的分離和洗脫方法。

強離子交換劑帶有容易離子化的官能基[例如四級胺類或磺酸類]。它們通常用於滯留和分離弱離子。這些弱離子的洗脫方式可以是置換移動相中的離子，這些離子可以更強烈地被吸引至固定相位點上。或者，弱離子可能會滯留在管柱上，然後以原位改變移動相pH值的方式進行中和，因此失去吸引力而洗脫出來。

弱離子交換劑[例如具有二級胺或羧酸官能基]可能會在高於或低於某個pH值時進行中和，失去以電荷滯留離子的能力。當它們帶有電荷時，會用於滯留和分離強離子。如果這些離子不能以置換方式洗脫出來，固定相交換位點可能會被中和，切斷離子吸引，洗脫出帶電荷的分析物。

當弱離子交換劑被中和時，可能以疏水[逆相]或親水[正相]作用來滯留和分離物質；在這些情況下，洗脫強度取決於移動相的極性[圖 R-1]。因此，弱離子交換劑可用於混合模式分離[同時基於極性和電荷的分離]。

表D概述離子交換主要類別的指南。例如，要滯留強鹼性分析物[始終帶正電]，請使用pH>7的弱陽離子交換固定相顆粒，就樣就能確保表面帶負電顆粒。若要釋放或洗脫強鹼化合物，請將移動相的pH值降至3以下，以除去表面電荷，切斷離子交換滯留機制。

請注意，pK_a是50%的官能基發生離子化，50%的官能基為中性時的pH值。為確保基本中性或完全帶電的分析物或顆粒表面，必須將pH值調整成比pK_a至少高2個單位的值，視情況而定[如表D所示]。

請勿使用強陽離子交換劑來滯留強鹼化合物，這兩者都帶電荷並會強烈相互吸引，導致鹼性化合物幾乎無法洗脫出來。此時若要洗脫，只能以滯留性更強的競爭性鹼性化合物來蓋過強陽離子交換劑，贏過活性交換位點的比賽，置換目標化合物。這種方法在HPLC和SPE中幾乎不太實用，也不太安全。[使用超強酸和超強鹼相當危險，可能會腐蝕用於HPLC流體的結構材料！]

基於粒徑的分離：粒徑篩析層析[SEC] – 凝膠滲透層析[GPC]

1950年代，Porath和Flodin發現生物分子可以根據大小，而不是電荷或極性來獲得分離，方法是使用一種可控多孔性的親水性右旋糖酐聚合物通過或過濾生物分子。這個過程稱為凝膠過濾。後來使用了類似方案來分離合成低聚物和聚合物，方法是使用具有特定孔隙大小範圍的有機聚合物填料。這個過程稱為凝膠滲透層析[GPC]。類似使用可控多孔性矽膠填料的分離稱為粒徑篩析層析[SEC]。1963年推出了第一台專為GPC應用而設計的商用HPLC儀器[請見〈參考資料3〉]。

以上這些技術通常會在已合成的固定相上進行，其孔隙大小分布的範圍能讓目標分析物進入填料或多或少的孔隙體積內，或從中排除出來。較小的分子會在通過層床時穿透更多孔隙。較大的分子只能穿透一定大小以上的孔隙，因此留在層床上的時間較短。最大的分子可能會完全被排除在孔隙之外，只在顆粒之間通過，可以在小體積中極快地洗脫出來。選擇移動相有兩個原因：首先，它們是分析物的良好溶劑；其次，它們可以防止分析物和固定相表面之間發生任何交互作用[基於極性或電荷]。這樣一來，以分子在溶液的大小遞減順序，較大的分子會先洗脫，較小的分子移動較慢[因為要進出更多的孔隙]，所以晚點洗脫。由此可見一個簡單法則：大的先出。

由於聚合物的分子量可與它在溶液中的大小相關聯，因此GPC徹底改變了聚合物分子量分布的量測方法，進而確定了可能提高或降低聚合物加工、品質和效能的物理特性[如何區分聚合物的好壞]。

總結

希望大家喜歡這篇關於HPLC的簡介。歡迎您閱讀參考資料並查閱附錄中的HPLC術語說明。