液相層析初學者指南

氧化鋁

一種多孔隙、顆粒形式的氧化鋁[Al₂0₃]，作為正相吸附層析法中的固定相。氧化鋁具有高活性的鹼性表面；10%水漿體的pH值約為10。連續用強酸洗滌可製成中性和酸性等級[漿體pH值分別為7.5和4]。氧化鋁的吸濕性比二氧化矽強。其活性是根據Brockmann†含水量標度測量的，例如，I級活性含水1%。

†H. Brockmann and H. Schodder, Ber.74: 73 (1941).

基線*

當只有移動相從管柱中流出時，記錄偵測器訊號值的層析圖部分。

匣式管柱

一種無末端接頭的管柱，只有一個開管，填充材料由兩端的篩板滯留。SPE匣式管柱可以在真空歧管上平行運作。HPLC匣式管柱置於一個保護管柱套中，每一端內建流體連接。與帶有一體式末端接頭的傳統管柱相比，分體式保護管柱易於更換、成本更低且更方便。

層析圖*

偵測器訊號值或其他定量的圖形或其他表示形式，做為量測流出物中分析物濃度與流出量或時間的關係。在平面層析[例如，薄層層析或紙層析]中，層析圖可以指含有分離區域的紙張或薄層。

層析分離*

一種動態物理化學分離方法，要分離的成分分布在兩相之間，一個是靜止的[固定相]，而另一個[移動相]會相對於固定相移動。

管柱體積* [Vc]

管子含有填料部分的幾何體積[管內橫截面積乘以填充床長度，L]。管柱的粒間體積，也稱為間隙體積，是填充床中顆粒之間的移動相所佔的體積。空隙體積[V₀]是移動相所佔的總體積，即間隙體積和粒內體積之總和[也稱為孔隙體積]。

偵測器* [請見〈靈敏度〉]

一種以量測物理或化學特性[例如，紫外線/可見光吸光度、示差折射率、螢光或導電度]，指出溶析液組成變化的裝置。如果偵測器的訊號值與樣品濃度呈線性關係，則使用標準品進行適當校準就能定量某種成分的含量。串聯使用兩種不同類型的偵測器通常很有幫助。這樣可以獲得樣品分析物更多的確證或具體資訊。某些偵測器（例如電化學、質譜分析）具有破壞性，也就是說會影響樣品成分的化學變化。如果這種類型的偵測器與非破壞性偵測器搭配使用，通常會置於流路中的第二順位。

顯示器

一種以層析圖形式在電腦螢幕上記錄偵測器電子訊號值的裝置。先進的數據記錄系統也會使用精細的演算法來執行計算，例如，積分波峰面積、減去基線、比對譜圖、定量成分，以及比較標準庫來鑑定未知物。

效率[H，請見〈平板數、解析度、靈敏度、速度〉]

量測管柱在通過填充床時阻止樣品譜帶擴散的能力。高效管柱可將譜帶擴散或譜帶分散的作用降到最低。效率高，才能有效分離、提高靈敏度和/或鑑定複雜樣品混合物中的類似成分。

諾貝爾獎得主Martin和Synge透過類似於蒸餾的方式，引進平板高度[H，或H.E.T.P.，相當於理論平板的高度]的概念，作為層析分離效率的量測標準，以及比較管柱效能的一種方式†。他們彷佛預知日後的HPLC和UPLC技術，深知填充盡可能小的顆粒[需要更高壓力]的均質層床，才是達到最高效率的關鍵。管柱和分離系統參數之間的關係會影響譜帶擴散作用，並在之後的van Deemter方程式中提出††。

層析分離人員通常會將能輕鬆計算以及直接從層析圖上完成量測（即平板數 [N]）的量稱為效率。然後根據柱床長度與N的比例值決定平板高度[H=L/N；從層析圖中計算N的方法如圖U所示]。需要注意的是，使用這些方法計算N或H僅適用於等度條件，不適用於梯度分離。

†A.J.P. Martin and R.M. Synge, Biochem.J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg and A. Klinkenberg, Chem.Eng.Sci.5: 271–289 [1956]

溶析液

從管柱出口流出的洗脫液部分，含有溶液中的分析物。在分析型HPLC中，偵測器會檢查溶析液中分析物的濃度或質量。在製備級HPLC中，會以均勻時間或體積間隔連續收集溶析液，或僅在偵測器指出預定波峰出現時才停止收集。這些收集起來的部分後續會進行加工，取出純化的化合物。

洗脫液

移動相[請見〈洗脫層析〉]。

洗脫序

參考標準吸附劑上的指定分析物，按洗脫強度排序的溶劑清單。這一系列在開發等度和梯度洗脫法時很有用。Trappe在證明出一系列極性增加溶劑可以分離氧化鋁上的脂質部分後，訂定了此一專有名詞†。後來，Snyder在數種正相LC吸附劑上的大量溶劑中量測出溶劑強度參數，並將其製成表††。Neher建立一套非常實用的列線圖，透過此圖可選擇正相溶劑的等洗脫[恆定洗脫強度]混合物，讓TLC分離發揮最大的選擇性†††。

典型的正相洗脫序會從弱端的非極性脂肪烴開始，例如戊烷或己烷，然後依次發展為苯[一種芳香烴]、二氯甲烷[一種氯化烴]、乙醚、乙酸乙酯[酯]、丙酮[酮]，最後是強端的甲醇[醇] [請見圖R-1]。

†W. Trappe, Biochem.Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], pp.192–197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] pp.75–86.

洗脫* [動詞]

以洗脫層析法進行層析分離。洗脫過程可能會在所有樣品成分仍在填充床上時停止[平面薄層或紙層析]，或繼續直到成分離開填充床[管柱層析]為止。

注意：為了避免與方法開發的做法混淆，最好使用「洗脫」一詞來進行開發[平面層析中使用的詞彙]，其中分離系統[移動相和固定相的組合]會針對特定分離進行最佳化。

洗脫層析*

一種層析分離程序，其中移動相會連續通過填充床。在HPLC中，當偵測器基線穩定且分離系統達到平衡之後，就會將有限的樣品流段引進流動的移動相流中。洗脫繼續進行，直到所有目標分析物都通過偵測器為止。

洗脫強度

固定相中溶劑親和力相對於分析物親和力的量測。弱溶劑不能置換分析物，會導致其強烈滯留在固定相上。強溶劑可能會完全置換所有分析物分子，並讓它們毫無保留地通過管柱。為了讓有效分離和合理沖堤量達到適當平衡，通常會混合溶劑以在固定相與移動之間建立起適當的競爭，進而讓一組指定分析物發揮最佳的選擇性和分離時間[請見〈選擇性〉]。

偶極矩、介電常數、氫鍵結、分子大小和形狀以及表面張力，可以用來代表洗脫強度。洗脫強度也取決於分離模式。在吸附或正相條件下，可以在一個方向上增加強度來排序溶劑洗脫序；在逆相分配條件下，這個順序可能幾乎相反[請見圖R-1]。

螢光偵測器

螢光偵測器會使用特定波長的光來激發樣品，讓某些化合物產生螢光並在更高波長下發光。將一台感應器設為特定的發射波長並裝有遮罩，使其不會被激發光源遮擋，只收集發出來的光即可。通常，天然不發螢光的分析物可以被衍生化，這樣就能善用這種偵測方式的高靈敏度和選擇性，例如AccQ•Tag衍生化的氨基酸。

流速*

單位時間內通過管柱的移動相體積。在HPLC系統中，流速會由溶劑輸送系統[幫浦]的控制器來設定。檢查管柱出口處定時收集和量測的流出物，即可確定流速的準確性。由於溶劑的密度會隨溫度變化，因此任何校准或流速量測都必須考慮這個變數。在可能的情況下，依據重量而非體積，會是最準確的測定。

流速的均勻性[精密度]和再現性對於許多LC技術而言都很重要，尤其是滯留時間為分析物鑑定關鍵的分離，或是凝膠滲透層析，其中滯留時間的校準和相關性是判定聚合物分子量分布量測準不準確的關鍵。

通常，分離條件是以線性速度來比較，而非流速。將流速除以管柱橫截面積可計算線性速度。流速以體積/時間[例如，mL/min]表示，而線性速度以長度/時間[例如，mm/s]來量測。

凝膠滲透層析*

分離處理主要根據因分子大小和/或形狀的差異而產生的篩析效應。凝膠滲透層析和凝膠過濾層析說明當固定相為膨脹凝膠時的過程。兩者都是粒徑篩析層析的形式。Porath和Flodin率先針對生物分子基於大小的分離提出使用右旋糖酐凝膠和水性移動相的凝膠過濾法†。Moore在多孔隙聚苯乙烯-二乙烯苯聚合物凝膠上使用有機溶劑移動相，將類似的原理應用於溶液中按大小分離有機聚合物††。

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
††J.C. Moore, U.S. Patent 3,326,875 [filed Jan. 1963; issued June 1967]

梯度

兩種[或更多]可溶溶劑成分的相對濃度會隨時間變化，形成洗脫強度增加的移動相。階梯梯度通常用於固定相萃取；在每個步驟中，洗脫液成分會突然從較弱的移動相變為更強的移動相。甚至可以在步驟之間將SPE吸附劑層床弄乾，從一種溶劑變為另一種不互溶的溶劑。

連續梯度通常由低壓或高壓混合系統[請見圖J-2和J-3]根據預先確定的曲線[線性或非線性]形成，這個曲線代表一段固定時間內更強溶劑B在初始溶劑A中的濃度。在連續梯度內的任何時間點，都可以設定保持固定等度溶劑組成。分離結束時，梯度程式也可以設定為回到初始移動相組成，以重新平衡管柱，為下一個樣品的進樣做準備。精密的HPLC系統可以將多達四種或更多種溶劑[或溶劑混合物]混合成連續梯度。

進樣器[自動進樣器，樣品管理器]

一種將離散、預定體積的樣品溶液精準無誤地引進[進樣]流動中移動相流的機制。進樣器可以是一個簡單的手動裝置，也可以是一個精密的自動進樣器，也就是可以設計成在無人看管的情況下，從一組單獨的樣品瓶或樣品孔中按預定順序進樣多種樣品。這些系統中的樣品箱甚至可以有溫度控制，能在運作多個小時後保持樣品完整性。

多數現代進樣器都整合了某種形式的注射器填充試樣環，可以依多口閥的方式來開啟或離線。最小內部體積進樣系統經過精心設計，最大限度靠近管柱進樣端，將樣品譜帶擴散的影響降至最低。在樣品進樣之間，還可以藉由移動相或洗滌溶劑沖洗到廢液中，防止殘留效應[目前樣品受到前一個樣品污染]。

如果可以，最好將樣品溶解在即將進樣的移動相中，以便為進樣做好準備，防止分離和/或偵測出現問題。如果必須使用另一種溶劑，其洗脫強度最好等於或小於移動相的洗脫強度。聰明的方式通常是，將少量樣品溶液與移動相離線混合，以檢驗可能影響成功分離的沉澱或混溶性問題。

進樣端

移動相液流和樣品進入柱床的一端。多孔隙惰性篩板會滯留填充材料，並防止吸附劑層床進樣端受到顆粒污染。恰當的HPLC做法是，要求樣品和移動相不含顆粒，這對於進樣端容易堵塞的小顆粒管柱是必須要求。如果柱床進樣端堵塞並且背壓高出正常值，有時倒轉流向，再同時將流出物引導至廢液，可能會移去並沖走位於篩板頂部的樣品碎屑。如果碎屑已穿透篩板並塞在柱床的進樣端中，管柱很可能再也無法使用。

離子交換層析* [請見〈基於電荷的分離〉一節]

這種分離模式主要是根據樣品成分的離子交換親和力差異。在小顆粒、表面多孔際、高效的離子交換管柱上，分離水中或緩沖水移動相中的主要無機離子物質，然後進行電導或電化學偵測，稱為離子層析[IC]。

等度洗脫*

移動相組成在洗脫過程中保持恆定的程序。

液相層析* [LC]

一種移動相為液體的分離技術。液相層析可以在管柱或平面[TLC或紙層析]上進行。使用更小顆粒和更高進樣端壓力的現代液相層析於1970年被稱為高效能（或高壓）液相層析[HPLC]。2004年，極致效能液相層析問世，LC的效能大大提升到一個新高度[請見〈UPLC技術〉]。

移動相* [請見〈溶析液，洗脫液〉]

在固定相吸附劑層床的長度上以特定方向滲透的流體。移動相可以是液體[液相層析]、氣體[氣相層析]或超臨界流體[超臨界流體層析]。在氣相層析中，移動相可以使用載體氣體這種方式來表達。在洗脫層析中，移動相也可以稱為洗脫液，而溶析液一詞的定義是，移動相已經通過吸附劑層床並含有溶液中目標化合物的部分。

正相層析*

一種固定相比移動相極性更強的洗脫程序。這個詞彙用於液相層析，強調與逆相層析的對比情形。

波峰* [請見〈平板數〉]

當一個成分從管柱中流脫出來時，記錄偵測器訊號值的不同層析圖部分。如果分離不完全，兩種或多種成分可能會洗脫為一個未解析的波峰。在最佳條件下，從填充良好、高效，並在譜帶擴散降至最低的系統中運作的管柱中洗脫出來的波峰，將接近高斯分布的形狀。通常透過量測波峰面積[以基線和波峰曲線包圍的地方]完成定量。峰高[從峰頂到基線量測的距離]也可用於定量，但比較少見。這個程序要求峰寬和峰型均保持不變。

平板數* [N，請見〈效率〉]

表示管柱效能的數字[機械分離能力或效率，也稱為平板計數、理論平板數]。這個數字是指，波峰滯留性的數量級與其寬度[變異數或譜帶擴散]有關係。為了計算平板計數，假設波峰可以用高斯分布[統計鐘形曲線]表示。在拐點[峰高的60.7%]處，高斯曲線的寬度是其平均值[位於峰頂點]標準差[σ]的兩倍。如圖U所示，在峰高其他部分量測的高斯曲線峰寬，可以用精確定義的σ倍數來表示。波峰滯留[滯留體積，簡稱V_R，或滯留時間，簡稱t_R]和峰寬必須以相同單位來表示，因為N是無因次數。請注意，計算N的5σ方法是管柱均勻性和效能更嚴格的量測標準，因為會受到波峰不對稱性更嚴重的影響。電腦數據站可以自動描繪每個解析的波峰，並計算其對應的平板數。

製備級層析分離

使用液相層析來分離一定數量和純度等級的化合物，以供進一步實驗或使用的過程。若是藥物或生物技術純化製備過程，直徑幾英尺的管柱可用於處理數公斤的材料。若是僅分離幾微克的貴重天然物，分析級HPLC管柱就足夠了。兩者都是製備級層析分離法，只是規模有所不同[請見〈HPLC規模〉一節和〈表A〉]。

解析度* [Rs，請見〈選擇性〉]

兩個波峰的分離表示為對應滯留時間的差異除以基線處的平均峰值寬度。R_s=1.25表示兩個等寬的波峰剛好在基線處分離。當R_s=0.6時，層析圖中兩個波峰的唯一視覺表示是，峰頂點附近的一個小缺口。效率更高的管柱會產生較瘦的波峰，提高棘手分離的解析度；但是，解析度增加僅與N的平方根有關。提高解析度最有效方法是，調整層析分離所用的移動相/固定相組合，藉此提高選擇性[請見〈化學分離能力〉一節]。

滯留因子* [k]

量測樣品成分滯留在固定相中的時間相對於滯留在移動相中的時間，表示樣品成分受到固定相阻滯的時間相比以移動相速度通過管柱所需的時間有多長。在數學上，這是調整的滯留時間[體積]與維持時間[體積]的比值：k=t_R'/t_M[請見〈滯留時間〉和〈選擇性〉]。

注意：過去，此詞彙也表示為分配比、容量比、容量因子或質量分配比，並用k'表示。

滯留時間* [tR]

洗脫開始[在HPLC中通常是進樣或樣品引進的時刻]和波峰最大值出現之間的時間。調整的滯留時間，簡稱t_R'，是t_R減去維持時間[簡稱t_M，完全未滯留的分析物從進樣到最高波峰洗脫的時間]計算得出的。

逆相層析*

液相層析中使用的一種洗脫程序，其中移動相的極性明顯高於固定相，例如一種微孔矽膠基質材料，將烷基鏈化學鍵結在其可接觸的表面上。注意：請避免使用不正確的逆相(reverse phase)詞彙。[如需逆相分離機制的一些新想法，請見〈參考資料4〉。]

選擇性 [分離因子，簡稱σ]

此詞彙用來說明針對組成分離系統的特定移動相和固定相，一對分析物的相對熱力學親和力之間差異的數量級。適當的詞彙是分離因子[σ]。它等於滯留因子的比率，k2/k1[請見〈滯留因子〉]；根據定義，σ始終≥1。如果σ=1，則兩個波峰會發生共洗脫，不會分離。在製備級層析分離中，務必要徹底提高σ才能達到最高的樣品負載量和通量。[請見〈化學分離能力〉一節]

靈敏度* [S]

進入偵測器的移動相中，物質的單位濃度或單位質量的訊號輸出，例如線性校準曲線的斜率[請見〈偵測器〉]。若是濃度敏感型偵測器[例如，UV/VIS吸光度]，靈敏度就是峰高與波峰分析物濃度的比率。若是質量流敏感型偵測器，靈敏度就是峰高與單位質量的比率。如果靈敏度是一個獨特的效能特性，就只能由化學量測過程來決定，而不是比例因子。

偵測[定性]或量測[定量]分析物的能力受許多儀器和化學因素的影響。從高效率管柱[瘦高峰，最大峰高的對稱性良好]洗脫出解析度良好的波峰[最大選擇性]，並獲得優良的偵測器靈敏度和專一性，是理想的情況。分離系統的干擾和電子元件噪音也應該徹底降低，才能達到最大靈敏度。

固相萃取[SPE]

一種樣品前處理技術，會使用LC原理從應用於微型填充床的複雜基質中分離、富集和/或純化分析物。離線SPE [手動或經由自動化]是指，在一個塑料萃取匣或微洗脫平板孔中使用較大的顆粒，再使用低正壓或真空來輔助流動而完成的做法。線上SPE是指，在微型HPLC管柱中使用更小顆粒，再使用更高壓力和一個閥門，將SPE管柱與主要HPLC管柱切換成線上或離線到廢液的做法，視情況而定。

SPE方法會使用階梯梯度[請見〈梯度〉]來完成層床活化、上樣、洗滌和洗脫等步驟。樣品通常會在重要分析物k越高越好的條件下上樣，以便在上樣和洗滌步驟中能充份滯留。然後切換到更強的溶劑混合物來完成洗脫[請見〈洗脫強度〉]。目標是去除基質干擾，分離溶液中的分析物，使其達到適合後續分析的濃度。

速度[請見〈效率、流速、解析度〉]

使用更小體積、更小顆粒的分析管柱，或更大體積、更大顆粒的製備級管柱，以更高的線性速度進行LC分離的優點。LC速度呈數量級進步分別是在1972年[使用10 μm顆粒和能夠在6000 psi下輪送準確移動相流量的幫浦]、1976年[使用75 μm製備級管柱，以500 mL/min的流速運作]，以及2004年[推出UPLC技術，1.7 μm顆粒管柱可在15,000 psi下運作]†。

高速分析LC系統不僅必須適應整個流體的更高壓力，進樣器的循環時間還得夠短、梯度混合器要能在樣品之間快速周轉、偵測器感應器必須快速反應洗脫液組成的微小變化，而且數據系統必須每秒收集幾十個點，以便準確繪製和定量瘦高峰。

這些優勢相結合，讓解析度更高、速度更快，效率更高，通量往往也更高。一個工作日內可以分析更多樣品。每次運作或每個處理週期可以純化更大量的化合物。

固定相*

形成層析分離系統的兩相之一，可以是固體、凝膠或液體。如果是液體，可能會分布在固體上。這種固體不一定有助於分離過程。液體也可以與固體化學鍵結[鍵結相]或固化在其上[固定相]。

填充床或吸附劑可以當作通用詞彙來表達，代表使用固定相的任何不同形式。

不建議使用液相一詞來表示LC中的移動相。避免混淆氣相層析中將固定相稱為液相[通常是指塗在撐體上的液體]的慣例。

開放式管柱的液液分配層析[LLC]無法順利轉換為HPLC。所以改為使用鏈結相填料。事實證明，LLC與現代偵測器不相容，因為固定相液體塗層會從其撐體上流失，導致污染不互溶的液體移動相。

UPLC技術

使用經過整體設計以適應sub-2 μm顆粒和極高運作壓力的高效LC系統，稱為極致效能液相層析[UPLC技術]†。與HPLC相比，該技術的主要優點是解析度大大提高，和/或運作時間加快，同時保持現有HPLC分離的解析度。

†欲知更多資訊，請造訪：https://www.waters.com/uplc