液相層析初學者指南

基本高效能液相層析[HPLC]系統的元件如圖E中的簡圖所示。

儲液瓶用於盛裝溶劑[因為會移動所以稱為移動相]。高壓幫浦[溶劑輸送系統或溶劑管理器]用於產生和計量移動相的指定流速，通常為毫升/分鐘。進樣器[樣品管理器或自動進樣器]能夠將樣品引入[進樣]連續流動的移動相流中，並隨著流動將樣品帶入HPLC管柱。管柱含有發揮分離處理作用所需的層析填充材料。填充材料稱為固定相，因為它固定在管柱硬體上。偵測器用來查看從HPLC管柱中洗脫出來的分離化合物譜帶[大多數化合物沒有顏色，因此用肉眼無法看出來]。離開偵測器的移動相可以視需要送至廢液處理或收集起來。當移動相含有分離的化合物譜帶時，HPLC可以收集含有該純化化合物的洗脫液餾份，以供進一步研究。這種方法稱為製備級層析分離[在〈HPLC規格〉一節有所探討]。

請注意，高壓管和接頭用於互連幫浦、進樣器、管柱和偵測器元件，以形成移動相、樣品和化合物分離譜帶的通路。

偵測器連接到電腦數據站，HPLC系統元件會記錄電子訊號，再產生層析圖並在顯示器上展現，用於鑑定樣品成分並定量濃度（請見圖F）。由於樣品化合物的特性可能各異，因此開發了多種類型的偵測器。例如，如果化合物可以吸收紫外線，則使用紫外線吸收偵測器。如果化合物會發出螢光，則使用螢光偵測器。如果化合物不具備這些特性，可以使用更通用的偵測器類型，例如蒸發光散射偵測器[ELSD]。最有力的方法是串聯使用多台偵測器。例如，將UV和/或ELSD偵測器與質譜儀[MS]結合用於分析層析分離的結果。這樣一來，只要進樣一次，就會知道分析物更全面的資訊。質譜儀與HPLC系統聯用的做法稱為LC-MS。

HPLC運作

圖G中的圖解清楚說明了我們分離樣品中所含化合物的方式，一看便明。

移動相從左側進入管柱，經過顆粒層床，從右側流出。流動方向以綠色箭頭表示。首先，請看上圖；它代表零時[進樣時]的管柱，此時樣品進入管柱並開始形成譜帶。此處顯示的樣品是黃色、紅色和藍色染料的混合物，在管柱進樣端顯示為一條黑色譜帶。[實際上，這個樣品可以是任何能溶解在溶劑中的物質；一般來說，化合物是無色的，且管柱內壁不透明，因此需要一台偵測器來查看洗脫分離出來的化合物。]

幾分鐘後[下圖]，移動相連續穩定地流過填充顆粒，可以看到各染料以不同的速度在不同的譜帶中移動。這是因為移動相和固定相之間對每種染料或分析物存在吸引競爭。注意看，黃色染料譜帶移動最快，即將離開管柱。黃色染料比其他染料更喜歡[容易被吸引至]移動相。因此，它的移動速度更快，更接近移動相的移動速度。相比移動相，藍色染料譜帶更喜歡填充材料。它對顆粒的吸引力更強，導致移動速度明顯變慢。換言之，它是該樣品混合物中滯留性最強的化合物。紅色染料譜帶對移動相的吸引力中等，因此會以中等速度通過管柱。由於每種染料譜帶各以不同的速度移動，所以能透過層析分離法分離。

什麼是偵測器？

當分離的染料譜帶離開管柱後，隨即就會進入偵測器。偵測器包含一個流體槽，可在移動相背景下看到[偵測]每個分離化合物的譜帶[請見圖H]。[實際上，在典型HPLC分析濃度下，許多化合物溶液是無色的。]合適的偵測器能夠感應化合物的存在，並向電腦數據站發出對應的電子訊號。如前所述，根據需要分離和分析之化合物的特性和濃度，可以選擇許多不同類型的偵測器。

什麼是層析圖？

層析圖表示的是HPLC系統中發生的化學[層析]分離。時間軸上繪有從基線升起的一系列波峰。每個波峰代表不同化合物的偵測器反應。層析圖由電腦數據站繪製[請見圖H]。

在圖H中，黃色譜帶已完全通過偵測器流體槽，產生的電子訊號被傳送到電腦數據站。螢幕上開始出現產生的層析圖。請注意，層析圖從一開始進樣就開始出現，顯示為螢幕底部附近的一條直線。這條直線稱為基線，代表隨時間通過流體槽的純移動相。當黃色分析物譜帶通過流體槽時，會向電腦傳送更強的訊號。曲線先上升再下降，與樣品譜帶中黃色染料的濃度成正比。於是就在層析圖中形成一個波峰。待黃色譜帶完全通過偵測器流體槽後，訊號水平恢復到基線；現在，流體槽又回到只有純移動相的狀態。由於黃色譜帶移動最快，最先從管柱中洗脫出來，因此是第一個繪製的波峰。

過了一會兒之後，紅色譜帶抵達流體槽。紅色譜帶一進入偵測器流體槽，訊號就會從基線上升，開始繪製代表紅色譜帶的波峰。這張圖中，紅色譜帶尚未完全通過流體槽。如果此時中途停止，紅色譜帶和紅色波峰就是圖中所示的狀態。由於大部分紅色譜帶已通過偵測器流體槽，因此已經繪出了大半波峰，如實線所示。如果重新開始，紅色譜帶可完全通過流體槽，並完成紅色波峰的繪製[虛線]。藍色譜帶滯留性最強，會以最慢的速度移動，在紅色譜帶之後洗脫出來。如果繼續運作到底，完整的層析圖就如虛線所示。有趣的是，藍色波峰的寬度是最寬的，因為藍色分析物譜帶的寬度雖然在管柱上最窄，但是從管柱洗脫出來時會變得最寬。這是因為它通過填充床的速度更慢，需要更多時間[和移動相體積]才能完全洗脫。由於移動相會以固定速率連續流動，所以藍色譜帶會變寬、變稀。由於偵測器反應與譜帶濃度成正比，因此藍色波峰的高度較矮，但寬度較大。