分取 SFC の入門ガイド

分析法に関する検討事項

精製のために分析法をスケールアップする場合、クロマトグラフィーがアプリケーションに最適であることが重要です。分析スケールで分離能が向上するということは、分取スケールでのクロマトグラフィーが向上し、その結果スループットおよびフラクションの純度が向上するということです。分析法では、カラムの加熱、注入モード、圧力降下、システム圧、および適合カラムなどの分取手法の条件も考慮に入れなければなりません。MS を用いて精製を実施する場合、分析スケールでのすべてのスクリーニングおよび分析法開発も MS 検出を使用して行わなければなりません。グラジエント法の場合、グラジエントの傾きおよび平衡化時間には、分析システムと分取システムとの間の容量差を考慮に入れる必要があります。多くの場合、分析用のロードはミックスストリームインジェクションを使用して行い、分取法ではモディファイヤーストリームインジェクションを使用するため、希釈溶媒の影響も考慮に入れる必要があります。

サンプル負荷量

負荷量試験は通常、注入方法の違いに留意して、まず小さな（分析）スケールで実施します。サンプルをシステムに注入する前に、サンプルに含まれる化合物の溶解度について知ることが重要です。分取アプリケーションにおける最良事例は最小量の溶媒で最大量のサンプル（高度に濃縮したサンプル）をロードできることです。しかしながら、サンプルは CO₂ と有機溶媒が混合した移動相にロードされた後も溶媒に溶解した状態のままでなければなりません。許容濃度が決定したら、サンプル負荷量試験を実施します。この試験では、分離能が失われるまで、またはターゲット化合物の高純度フラクションを取得するのにクロマトグラフィーが使用できなくなるまで注入量を段階的にに増加させます。

スケールアップの成功のための一般的要件

適切な分析法が開発され、分析スケールでの負荷量試験が完了したら、スケールアップでの保持力と選択性が同じ（またはほぼ同じ）になることが理想的です。クロマトグラフィーのスケールアップを成功させるには、以下の複数のパラメーターを一定に保つ必要があります：

■ 移動相は同一でなければなりません。つまり SFC の場合、共溶媒（溶媒 B）が同一で、CO₂ が品質、インレット圧、物理的状態（液体または気体）、および送液方法が同一でなければならなりません。

■ 異なるスケールでクロマトグラフィーが一致する可能性を最大限にするために、カラムはケミストリー、長さ、および粒子径が同じである必要があります。分析スケールで粒子径が小さいカラムが使用されている場合、カラム長と粒子径の比（L/dp）がカラム間で同じでなければなりません。

■ サンプルは同じ希釈液に同じ濃度で溶解する必要があります

幾何学的スケールアップ

分取 SFC では、LC の場合と同様、注入量（負荷量）および流速を幾何学的にスケールアップします。

ピーク形状およびローディングキャパシティを維持するには、カラムサイズに応じて注入量をスケールアップする必要があります。負荷量は以下の等式で決定されます：

この場合、Vol は注入量（µL）であり、D はカラムの内径（mm）、L はカラムの長さ（mm）を表します。

同様に、分離の質を維持するには、カラムサイズに基づいて流速をスケールアップします。長さと粒子径が同じカラムの場合、流速の幾何学的スケールアップは以下のようになります：

この場合、F は流速（mL/分）、D はカラムの内径（mm）を表します。

デュエルボリュームとカラム外ボリューム

カラムが同じ長さの場合、分取法におけるグラジエントプロファイルをデュエルボリュームに基づいて変更する必要があります。これらの調整を行うには、デュエルボリュームを分析システムと分取システムの両方で測定しなければなりません。デュエルボリュームを決定するには、一般的に UV シグナルが得られる化合物または溶媒を共溶媒に添加し、カラムなしでグラジエントを実行します。ポンプでのグラジエント開始と検出器でのシグナル変化との間の時間遅延に基づき、時間遅延に流速を掛けることでデュエルボリュームを決定できます（図 25）。

また、チューブ、注入バルブ、ループサイズ、検出器フローセル、スプリッターなど、最終クロマトグラフィーでバンド拡散をもたらす可能性のあるカラム外ボリュームの影響にも注意が必要です。カラム外ボリュームとバンド拡散を測定するために、カラムを取り外し、注入を行います。注入から検出までの時間に流速を掛けるとカラム外ボリュームとなります。カラムがない状態でのピーク形状は、カラム外ボリュームが原因で発生する広がりを示します。システムはモディファイヤーストリームインジェクション用に接続されていたため、カラム外ボリュームを注入後の CO₂ 添加なしでより正確に決定できるように、注入を 100% 共溶媒で実施しました。この手順の詳細は、www.waters.com からアクセスできるオンラインアプリケーションの分取 OBD カラムカリキュレーターで説明されています。このカラムカリキュレーターは、分析から分取へのすべてのスケールアップの計算に役立つ使いやすいツールです。

移動相密度に関する検討事項

LC の単純なスケールアップルールは、SFC に適用可能ですが、移動相密度が一定であることを前提としているため直接は適用できません。SFC におけるスケールアップはより複雑ですが、その主な原因はカラム内部およびシステム間で密度、圧力および温度のばらつきを引き起こす移動相の圧縮性です。これらのファクターのばらつきが、移動相の組成と強度に影響を与えます。その結果、保持力と選択性が影響を受け、分析スケールのシステムと分取スケールのシステムの間で分離プロファイルを維持することがより困難になります。

密度および温度におけるばらつきは直接制御できませんが、SFC における以下の分析法パラメーターを調整することでクロマトグラフィーを複数のスケールで一致させることができます：

■ システム間の平均圧力（およびその結果として平均密度）を一致させる。平均圧力は入口圧力と背圧（出口圧力）の合計を 2 で割ったものです。カラム内部にわたりほぼ同じ圧力（密度）プロファイルを維持するために、入口圧力と背圧を分析装置または分取装置の自動圧力レギュレーターの設定を変更することで一致させることができます。平均圧を一致させることで必ずしも密度プロファイルが一致するわけではないことに留意しなければなりませんが、プロファイルにより高い一致が見られます。

■ 二酸化炭素および共溶媒の移動相組成の正確な一致。これは同等の移動相を得るためのシステム間における体積流速から質量流速（分析の場合）または質量流速から体積流速（分取の場合）への単位変換です。

SFC では共溶媒組成がピーク保持を制御する最も重要なパラメーターです。そのため、共溶媒組成を正確にスケールアップすることが分析法のスケールアップでは非常に重要です。質量流速および CO₂ と共溶媒の組成をカラム出口の圧力および温度と共に一致させることで、体積流速に基づく装置から質量流速に基づく装置へのより信頼性の高いスケールアップを行うことができます。

スケールアップの例

この例では、以下のパラメーターを使って UPC²システムで分析法を開発しました（表 6）：

カラム長および粒子径を一定に保つため、分取システムでは 5 µm の粒子が充塡された 21 × 150 mm の Chiralpak IA カラムを使用しました。注入量を幾何学的にスケールアップし、内径 4.6 mm のカラムでの 10 µL の注入は内径 21 mm カラムでの 208 µL の注入に相当します。この場合、分析システムの CO₂ ポンプは体積流速で制御されており、分取システムのポンプは質量流速で制御されていました。そのため、幾何学的スケールアップを計算する前に分析法の CO₂ 流速を質量流速に変換する必要がありました。この変換には以下の式を用いました。

■ CO₂ 流速 = 2.67 mL/分

■ CO₂ 密度 = 0.89 g/mL

■ CO₂ 流速（質量）= CO₂ 流速 × CO₂ 密度

■ CO₂ 流速（質量）= 0.89 × 2.67 = 2.38 g/分

共溶媒はそのままのスケール（mL から mL）で、共溶媒流速は 0.33 mL/分 であったため、合計分析流速は約 12% メタノールで 2.70 g/分 でした。この流速および割合を幾何学的にスケールアップしたため、12% の共溶媒条件での 21 × 150 mm カラムにおける分取流速は 56 g/分 となりました。

流速および組成が決定したら、同じ平均圧力を使用して密度プロファイルを分析システムと一致させる必要があります。分析システムの入口圧力は 162 bar、背圧は 120 bar（圧力降下 42 bar）であったため、平均圧は 141 bar と算出されました。分取システムにおける圧力降下はわずか 24 bar であったため、分析システムと平均圧力を一致させるためには、背圧を 130 bar に設定する必要がありました。最後に、温度も 35 ℃ で一致させ、以上のパラメーターを使用して ACQUITY UPC² から分取 SFC システムへの分離のスケールアップが成功した例を図 26 に示します。プロファイルは同じですが、分取システムでは保持時間がわずかに長くなっています。これは注入方法の違いによるものと考えられます。分析システムではミックスストリームインジェクションを使用し、分取システムではモディファイヤーストリームインジェクションを使用しました。

スタックインジェクション

多くのアプリケーションでは、スタックインジェクションが使用されます。スタックインジェクションは注入サイクル間の時間を短縮し、溶媒使用量を最小限に抑えます。また、スタックインジェクションは連続分離と精製のために使用可能なクロマトグラフィースペースをすべて利用することで、スループットが大幅に向上します。通常、すでに注入されたサンプルがカラムにある状態（またはカラムから溶出中）で注入が行われます。したがって、スタックインジェクションを利用するには、アイソクラティック分析法を用いることが必要です。スタックインジェクションを成功させるには、適切なサイクル時間（または注入間の時間）を決定する必要があります。また、一連の注入の最後の注入には、すべてのピークのセットが溶出されて分取されるようにするための合計実行時間が必要です。図 27 では、これらの値がどのように決定され、一連のスタックインジェクションで使用されるかを確認いただけます。サイクル時間は合計実行時間の約半分であるため、最初のターゲットピークが溶出され始める前にすでに 2 回の注入が実施されます。最後の注入の実施後には、2 セットのピークが溶出され、分取されます。この場合、スタックインジェクションを使用することで、従来の 1 回の注入による分析と比べて合計解析時間が半分になります。

アプリケーション例

すでに説明したように、SFC は選択性の範囲が拡大しているため、多種多様なアプリケーションに適しています（表 7）。

表 7.分野別の分取 SFC アプリケーション

分野や精製の目的にかかわらず、分取 SFC では以下が実現します：

■ 使いやすいシングルプラットホームにおける多様な選択性

■ さまざまなクロマトグラフィーのスケールアップ

■ 生産性の向上および溶媒の節約

■ 逆相 LC に対する補完性

■ 構造的に類似した化合物の分離および精製

このセクションでは、抜粋したアプリケーションの例を提示し、さまざまなワークフローとアプリケーションを紹介します。これらのアプリケーションはすべて、ウォーターズのウェブサイト（www.waters.com）でご覧いただけます。

SFC による揮発性フレーバー化合物および香料のキラル精製

SFC の主なアプリケーションの 1 つがキラル分離です。キラル薬物のエナンチオマーが異なる薬理活性を呈するのと同じく、フレーバー化合物および香料化合物の立体化学により、味、匂いの質、および強度が決まります。これらの化合物は揮発性であるため、精製が非常に難しいことがあります。SFC はキラルのフレーバー化合物および香料化合物の高い回収率を実現するための迅速な低温のオプションになります。

以下の例では、キラル分取 SFC でスタックインジェクションを用いてリナロールおよびテルピネン-4-オールのエナンチオマーをそれぞれラベンダーオイルとティーツリーの精油から精製しました。図 28 に、4.6 × 250 mm AD-H カラムでの分析法をセミ分取 10 × 250 mm AD-H カラムにスケールアップした例を示します。ティーツリーオイルの分離ではテルピネン-4-オールのエナンチオマーが両方存在しますが、ラベンダーオイルにはリナロールのエナンチオマーの片方しか含まれていません。分取 SFC 法のパラメーターを表 8 に示します。

この方法はアイソクラティックであったため、スタックインジェクションを使用して分取効率を最大化しました。クロマトグラフィーに基づくと、サイクル時間はティーツリーオイルで約 3 分、ラベンダーオイルで 2 分でした。スタックインジェクションを使用して得られたキラル精製を図 29 に示します。50 mg のティーツリーオイルは 40 分未満で分取され、30 mg のラベンダーオイルは 30 分未満で分取されています。

フラクション分析を図 30 に示します。3 つのフラクションすべてで純度が 92% を上回っていました。回収率試験をテルピネン-4-オールとリナロールのラセミ体標準試料を使用して実施したところ、回収率は 70 ～ 80% でした。非常に低い回収率が通常報告されていることを考えるとこの結果は注目に値します。

質量情報をフラクションのトリガーとして用いた医薬品化合物のアキラル精製

UV 検出を用いた精製の場合、ピークを検出器で区別することができません。多くの化合物は同じ波長を吸収します。質量分析計を用いた精製では質量情報に基づいてフラクションを分取します。ターゲット化合物とその他の不純物を区別できるため、質量情報は非常に特異性の高いパラメーターです。原薬が合成される場合、中間体が不純物として最終生成物に含まれることがあります。

イマチニブは、複数のがんの治療に使用されるチロシンキナーゼ阻害薬です。イマチニブの合成において、反応中間体および最終生成物を精製しました。最初のステップでは、3 種類のアキラルカラムとメタノールを水酸化アンモニウムの添加剤ありとなしで用いて混合物をスクリーニングしました。スクリーニングの結果を図 31 に示します。水酸化アンモニウムを用いた BEH 2-EP カラムとメタノールがスケールアップの最適な分析法パラメーターとして選択されました。

スケールアップのための分離を最適化するために、中間体と生成物について別々にフォーカスグラジエントを開発しました。溶出時の共溶媒の濃度を、スクリーニンググラジエントの傾きおよび目的の各ピークの保持時間に基づいて算出しました。中間体は共溶媒が 14% で溶出され、生成物は共溶媒が 29% で溶出されました。2 分間のフォーカスグラジエントをこれらの割合を中心に開発し、5% 低い値から開始して 5% 高い値で終了しました。

スケールアップでは、同じカラムケミストリーを使用し、カラム長と粒子径の比率（L/dp）は一定に保ちました。1.7 µm の粒子を充塡した 3 × 50 mm の分析カラム（L/dp = 29.4）を、5 µm の粒子を充塡した 19 × 150 mm の分取カラム（L/dp = 30）にスケールアップしました。スケールアップ後のクロマトグラフィー（フォーカスグラジエント）および質量情報に基づく分取を図 32 に示します。