コンバージェンスクロマトグラフィーの入門ガイド

前章で説明したように、CC は分離の観点から LC と類似しています。装置の観点からも、システム全体を設定値より上に加圧する ABPR が追加されたことを除き、すべての点で CC は LC システム（図 7 を参照）と類似しています。CO₂ ベースの移動相の利点を活かし、UPLC の最新のメリットを付与するために、ウォーターズは、低拡散で耐圧性の ACQUITY UPLC システムを、主要なシステムコンポーネントが CO₂ などの圧縮溶媒に適合するように改良しました。中でも注目すべきは、CC システム中のフローを測定するための液化 CO₂ ポンプを搭載したことです。CO₂ がはじめに液化しますが（例：13℃）、メタノールやアセトニトリルのほぼ 3 倍の圧縮性があります。したがって、再現性のあるコンバージェンスクロマトグラフィーを実現するには、ポンプを改良する必要がありました。

従来の分析 SFC システムの課題

歴史的に、分析 SFC システムは信頼性が低いことで有名でした。分析 SFC システムはすべて LC システムを流用したものであり、LC 用に設計されたポンプ、インジェクター、検出器は、圧縮 CO₂ で使用できる設計になっていませんでした。

シングルステージ LC レシプロポンプは、CO₂ を正確かつ確実に、繰り返し圧縮して送液することができませんでした。CO₂ のような圧縮性を持つ液体に対応するように設計されていないため、移動相の質量流速や質量組成にばらつきが発生しました。その結果、移動相の溶媒和力が変化し、多くの場合、注入間やシステム間の保持時間のシフトとして現れます。

高圧縮性の CO₂ ベースの移動相では、ポンプや背圧レギュレーターから発生するノイズによっても分析感度が低下します。また、パーシャルループ注入の正確性と精度が低いという大きな問題のため、流用する HPLC 装置はフルループインジェクションに限られることが多く、注入量の選択肢が限られます。システムレベルでは、流用する HPLC 装置ではバンド拡散の大幅な増加により、不要なバンド広がりが起こり、より効率的な 1.7 mm パーティクルカラムが使用できなくなります。これらの欠点のため、LC を流用した CO₂ ベースのシステムでは、潜在的なスループットと達成可能な性能が大きく制限されます。

では次に、ACQUITY UPC² システムの各モジュールに使用されているイノベーションを見ていきましょう（図 7）。

溶媒制御テクノロジー（ポンプ）

移動相の流速および組成を正確かつ精密に制御するには、システムの流路全体を見る必要があります。前述したように、流用した HPLC ポンプは、指定量の溶媒の圧縮と正確な送液を同時に行うように設計されていますが、液体の CO₂ ほど圧縮性のある流体を取り扱うことはできません。一部の SFC 装置では、流入する CO₂ は、予備圧縮・冷却のためのデバイスを通過します。このデバイスはクロマトグラフィーシステムと並べて設置されます（図 8）。CO₂ 密度は室温に依存して予備圧縮ステップと送液ステップの間で変化するため、このデバイスの設置位置がポンプから離れるほど、CO₂ 質量流速を正確に制御することが難しくなります。さらに、一般的に圧縮性のない液体を送液するために設計されている従来の SFC システムのポンプアルゴリズム（内部制御ソフトウェア）では、組成の正確さ、精度および保持時間の再現性を維持することが困難です。低濃度（5% 未満）の共溶媒を確実に送液しようとする場合にも同じ問題が発生し、多様な極性を持つ混合物の分析が難しくなります。

対照的に、Waters ACQUITY UPC² バイナリーソルベントマネージャー（BSM）は、質量流速および質量組成を十分に制御するために完全に統合された予備圧縮デバイスで圧縮流体を制御することに特化して設計されているため、信頼性と再現性の高い保持時間が得られ、ベースラインノイズもごくわずかとなります。前述したように、圧縮性流体システムでは、溶媒密度が移動相の溶媒和力を左右するため、再現性のための精密な制御が必須です。圧縮液体コンポーネントと非圧縮液体コンポーネントに必須の独立した制御アルゴリズムにより、低濃度の共溶媒などのさまざまな移動相組成が正確に混合され（図 9）、再現性のあるグラジエントプロファイルが実現します（図 10）。

分析 SFC システムで、特にグラジエント分離において、これほど精密な制御レベルに達したことはありません。ACQUITY UPC² システムは、ポンプ吸入量、圧縮および送液を精密に制御するように設計されており、超高性能 LC に期待される再現性が得られます。ACQUITY UPC² BSM で利用されている体積密度制御は、質量流速制御よりも優れており、卓越したクロマトグラフィー精度を発揮します。その結果、溶出時間が制御され、溶媒和強度も非常によく制御されます。ポンプヘッド自体が独立して冷却されるため、CO₂ の密度制御が向上し、精密な質量送液が得られます。ポンプおよび統合圧縮アルゴリズムは非常に有効で精密に制御できるため、液体と気体のどちらの CO₂ でも最初の移動相として使用可能です。図 11 に BSM の内部の様子を示します。共溶媒ポンプは UPLC ポンプですが、CO₂ ポンプは黒い絶縁カバーに覆われています。ポンプに圧縮・冷却デバイスが内蔵されているため、この絶縁カバーにより流入する CO₂ の密度がより精密に制御されます。

サンプル注入

従来の分析 SFC システムでは、フルループインジェクターの場合もパーシャルループインジェクターの場合も、少量のサンプルを注入した場合の再現性が低いという問題がありました。ほとんどの場合、フルループ注入のみが可能で、パーシャルループ注入では、注入溶媒の均一性を維持するのが困難でした。そのため、正確性、精度、直線性が損なわれ、分析種の定量ができませんでした。分析あたりのサンプルロスを少なく抑えるためには小さいサンプルループに手作業で交換する必要があるため、システムの柔軟性が損なわれました。

ACQUITY UPC² サンプルマネージャーには新規のデュアル注入バルブ設計（図 12）が採用されています。この設計では、プライマリーサンプルループは排出口に導かれるため、サンプルを大気圧でループに注入しながら移動相の超臨界状態を維持することができます。また、補助インジェクションバルブも設計に組み込むことで、サンプル注入ごとの圧力変動とキャリーオーバを抑え、併行精度が良く再現精度の高いパーシャルループインジェクションを可能にしました（図 13）。0.1 ～ 50 µL の範囲で 0.1 µL 刻みに注入できるだけでなく、デュアルニードル洗浄オプションによって、サンプルのキャリーオーバーがほぼ解消されます。図 14 に、パーシャルループ注入を 1 ～ 10 µL の範囲で 1 µL 刻みに増やした場合の注入の直線性を示します。

光学検出

分析 SFC システムの光学検出にはトラブルが少なくありません。HPLC システム用に設計された検出器フローセルは、拡散容量とベースラインノイズが許容範囲を超えています。示差屈折率検出器を SFC で使用すると、ポンプシステムによるノイズが増幅し、圧縮流体によるベースラインノイズやベースラインの湾曲が大きくなります。逆相 LC に一般に使用されるメタノールや水などの溶媒の屈折率は RI 値が非常に類似しているため（図 15）、逆相分析法では RI の影響があまり大きくありません。一方、CO₂ は、メタノール（最も一般的な共溶媒）と RI 値が大きく異なるため、屈折率の範囲が LC よりも広く、ベースラインノイズが大きくなって感度が制約を受けます。密度はさらに問題で、CO₂ ベースの移動相の屈折率は、グラジエント分析の過程で変化します。

ACQUITY UPC² PDA 検出器は圧縮流体専用に設計されています。ACQUITY UPC² PDA 検出器では、低 UV 波長でエネルギースループットが損なわれるサファイアレンズの代わりに、分離の間に生じる背圧に耐えられる強化シリカレンズを使用しました。これによって感度が最大化し、ベースラインノイズが低減し、CO₂ と有機溶媒の間の RI の影響の差が補正されました。また、光学ベンチの温度を制御することで、ベースラインの安定性が向上し、RI の影響が軽減しました。さらにステンレス製の低拡散フローセルによって狭いピーク幅に適応し、10 mm の光路長によって感度が最大化するとともに最適なスペクトル性能が維持されました。その結果、卓越した感度が実現し、微量の不純物も定量できるようになりました（図 16）。

質量分析（MS）検出

CC の圧縮性移動相に光学検出を適応させるための固有の装置要件と同様、CC を MS に接続するには移動相の圧縮率に対応するための改良が必要です。CC-MS インターフェースは、現在使用されている質量分析計のイオン源において移動相が圧縮状態から大気圧へと減圧できるものでなければなりません。移動相の圧縮率を慎重に考慮しなければ、イオン源への分析種の移送に悪影響が及びます。分析種の移送が不良であると、ピーク形状が不良になったり、イオン化が不良になったりする可能性があります。最悪の場合にはイオン化が起こらず、目的の分析種が質量分析計で検出されなくなります。

圧縮移動相の減圧は、移動相の流速、移動相の組成、そして自動背圧レギュレーター（ABPR）によって設定されるポストカラムシステム圧とは独立に制御される必要があります。さらに、減圧は分析種のイオン源への効率的な移送を妨げずに行うことが必要です。これらの目的を達成するために、ACQUITY UPC² 質量分析計のインターフェースは、圧縮移動相用に設計され、メイクアップ溶媒を用いるスプリットフローインターフェースを採用しています。質量分析計のインターフェースでは、通常 300 ～ 500 µL/分（圧縮状態）の一定流速の移動相をスプリットリストリクターから質量分析計へと導入します。残りの移動相は、移動相の幅広い流速と組成にわたり、ポストカラムシステム圧を制御するために ABPR へと向けられます。ACQUITY UPC² 質量分析計インターフェースの概略図を図 17 に示します。この図ではスプリットインターフェースとメイクアップ溶媒の添加が示されています。

CC-MS インターフェースにおいて、メイクアップ溶媒はさまざまな役割を担っています。まず、モディファイヤーが 5% 未満の場合、主にエレクトロスプレーイオン化（ESI）で必要になります。ESI は液相イオン化手法であるため、イオン化するにはある程度の量の液体が必要です。したがって、移動相モディファイヤーの割合が非常に低い場合は、移動相に含まれる液体の量では ESI に不十分です。そこで、ディファイヤーの割合が低い ESI では、メイクアップ溶媒の形で液体を添加することが必要になります。次に、メイクアップ溶媒は分析種の移送に役立ちます。スプリットリストリクターのあるポイントにおいて、CO₂ は高圧高密度状態から気体状態になり、溶媒和力を失います。したがって、CO₂ が気化した後は、分析種の溶解とそのイオン源への移送に使用できるのは液体モディファイヤーのみになります。分離に使用するモディファイヤーの割合がゼロまたは極めて低い場合、イオン化するために分析種をスプリットリストリクターを通してイオン源まで移送する液体がなくなります。このような条件下で分析種のイオン源への移送を助けるために、メイクアップ溶媒をスプリットリストリクターの上流で添加します。分析種の移送が良好な場合と不良な場合を示すピークプロファイルの例を図 18 に示します。この場合、分析種移送が不良（18A）および良好（18B）になるようにメイクアップ溶媒の流速を選択しました。

メイクアップ溶媒は、移動相液体モディファイヤーへの分析種の溶解度が限られている場合の分析種の移送にも重要な役割を担います。分析種の溶解度は、液体モディファイヤーと圧縮二酸化炭素の混合物に対しては高く、液体モディファイヤー単独に対しては低いことがあります。このような場合、液体モディファイヤーの割合が大きくても、スプリットリストリクター中で CO₂ が気化した後に分析種が析出する場合があります。液体モディファイヤーへの分析種の溶解度が不十分である場合、不完全なピーク形状、インターフェースチューブの詰まり、ピーク再現性の低下などが結果として生じます。適切なメイクアップ溶媒を添加して新たに得られた液体モディファイヤーとメイクアップ溶媒の混合液により、分析種の溶解度を高めることで、このような問題を回避するのに役立ちます。例えば、親油性の高い分析種は、CO₂/メタノール移動相には溶解度が高く、メタノール単独には溶解度が低くなる可能性があります。このような場合、非極性メイクアップ溶媒を添加して液体共溶媒とメイクアップ溶媒を混合させることで実質的な極性を低下させることができます。親油性分析種は、低極性溶媒の混合液では溶解度が高くなるため、より簡単にイオン源へと輸送されます。

必要であれば、CC-MS インターフェースのメイクアップ溶媒からイオン化を促進する化合物を質量分析計に導入することもできます。これらの化合物は、カラム後に添加でき、分離に影響することがありません。5% の水（体積）や 20 mM の水酸化アンモニウム、ギ酸、または酢酸アンモニウムなどのイオン化促進化合物のいずれかにより、多くの場合、ESI におけるイオン化効率が向上します。イオン化促進化合物の濃度および種類は分析種により大きく異なり、最適なレスポンスを得るにはアプリケーションごとに調整が必要です。

メイクアップ溶媒の組成を選択したら、メイクアップ溶媒の流速も調整することで、最適なレスポンスを得ることができます。MS レスポンスに対して幅広い流速のスクリーニングが可能です。流速が低すぎると移送が不十分になることがあり、メイクアップ溶媒の流速が高すぎると多くの場合、MS シグナルが低下します。メイクアップ溶媒の組成と同じく、メイクアップ溶媒の最適な流速も分析種および分析法により異なり、最大シグナルレスポンスが必要な場合は、新しいアプリケーションごとに最適化する必要があります。さらに、例えば ESI から大気圧化学イオン化（APCI）への切り替えなど、イオン化手法を切り替える場合には、メイクアップ溶媒の組成および流速を再度最適化する必要があります。

要約すると、ACQUITY UPC² 質量分析計のインターフェースは、圧縮移動相専用に設計され、ESI、APCI、ESCi マルチモードイオン化、大気圧光イオン化（APPI）および UniSpray などの大気圧イオン化法を採用している最新の質量分析計との接続に特化して設計されています。

背圧の制御

圧縮性溶媒をベースにしたシステムにとって、正確にシステム内の圧力を制御できることが最も重要な要素の一つです。背圧の制御が精密でないと、移動相の密度に大きく影響し、分析種の溶媒和や保持時間にも大きく影響します。従来の SFC システムは、背圧の制御の正確さと精密さに欠けるという問題がありました。その要因は、自動背圧レギュレーター（ABPR）の圧力モニタリングの悪さ、フィードバックループのレスポンスの遅さ、ステッピングモーターの分解能の低さ、ポンプの圧力と流速の制御能力の低さ、ABPR の部品の経時劣化などです。

ACQUITY UPC² システムでは、革新的な 2 段階のアクティブ背圧レギュレーター/スタティック背圧レギュレーターにより背圧の制御が向上しています（図 19）。アクティブ背圧制御/スタティック背圧制御を組み合わせることにより、スタティック背圧レギュレーターがシステムを最小圧力に保ち、アクティブ背圧レギュレーターがユーザーが定めた設定値の制御を強化します（図 20）。さらに頑健性を高めるために、スタティック BPR のカートリッジを加温することで、ABPR の出口での急速な減圧に伴う移動相の凍結が軽減します。2 段階背圧レギュレーターは、ACQUITY UPC² システムのコンバージェンスマネージャー（CM）に搭載されています（図 21）。また、このモジュールには、流入する CO₂ 用のインラインの微粒子フィルター、CO₂ リーク検出器、ベントバルブ、圧力開放バルブおよび補助注入バルブも備わっています。

全体的なシステムの性能

このように、ACQUITY UPC² システムは ACQUITY UPLC システムと同様、拡散が小さくなり、内径の細いカラムや充塡剤の粒子径が小さなカラムを使用できるようになりました（図 22）。内径の小さいカラムによって感度が向上し、溶媒の消費量が抑えられ、質量分析により適した流速の使用が実現しました。また、粒子径の小さなカラムにより分離効率と分離能が向上しました。