コンバージェンスクロマトグラフィーの入門ガイド

すべてのクロマトグラフィー分離の基本メカニズムは、サンプル混合物に含まれるすべての分析種分子が異なる速度でシステム内を移動するような条件を確立し、分析カラムから溶出する際に互いに十分に分離されて検出および定量されるようにすることです。このプロセスを実行するために、クロマトグラフィーには固定相と移動相という 2 つの主な構成要素があります。固定相の主な役割は、化合物の移動を停止させる、または保持することであり、一方、移動相の主な役割は、化合物をホールドしシステムの入口から出口まで化合物を移動させることです。これが GC、LC および CC の基本的メカニズムです。CC と LC や GC との間の主な違いは、移動相の性質がそれぞれのクロマトグラフィー挙動にどのように影響を及ぼすかです。

LC や GC との比較における CC での移動相の役割

GC では、移動相は通常、不活性ガスや非反応性ガスで、一般的にはヘリウムや窒素です。GC の動作温度と動作圧力では、移動相は、分析種分子を溶媒和することも固定相を修飾することもできません。GC の移動相は主に、GC カラムを通して分析種分子を運ぶキャリアやドライバーとして作用します。分析種の保持および分離は、分析種分子と固定相の間の相互作用によってのみ行われます。これは、分析種分子と固定相の間の相互作用によってのみ行われます。これについて図 3 に概略を図示していますが、分析種分子の周りに空間があります。

一方、LC では、移動相が積極的な役割を担い、移動相の分子は、分析種分子と固定相の両方と強く相互作用します。移動相は、分析種と直接溶媒和するだけでなく、固定相表面を競合して分析種と固定相の相互作用に影響することで、分析種の保持に影響を与えます（図 3）。 

図 3 に RPLC モードと NPLC モードの LC を示します。これら 2 つの LC モードの間の主な違いの 1 つは、移動相の組成、つまり RPLC は水ベースで、NPLC は有機溶媒ベースである点です。RPLC では、水ベースの移動相を C₁₈ 固定相と組み合わせて使用することで、分析種と固定相の間の相互作用が効果的に調節され、これがさまざまな化合物の混合物であるサンプルの分析種を分離する上で大きな役割を担います。RPLC 分析法開発では多くの場合、最初の変更は、固定相ではなく移動相に対して行います。一方、NPLC では、ヘキサンまたはへプタンベースの移動相が比較的穏やかな役割を果たし、分離は主に固定相ケミストリーを変更することで行われます。

CC における移動相の役割は、CO₂ のユニークな特性（超臨界かどうかにかかわらず）のため、RPLC と NPLC の中間です。圧縮 CO₂ は、ヘプタンやヘキサンと同じ非極性です。これに基づくと、CC は NPLC に近いと言えます。ただし、1 つの主な違いとして、CO₂ はメタノール、エタノール、アセトニトリルなどの極性の共溶媒と完全に混合します。したがって、ほとんどの場合アイソクラティックモードで使用される NPLC とは異なり、グラジエントモードで使用できます。また、CC の移動相は NPLC と比べて、分析種の溶出で強力な役割を担う少量の水に対してはるかに影響を受けにくくなっています。

次のセクションでは、CC と RPLC や NPLC との系統的な比較を、主な溶媒の特性の違いに基づいて説明します。

クロマトグラフィー挙動に対する影響における CO2 の性質の役割

他の溶媒との CO2 の混和性

CO₂ は、ヘプタン（= 0.1）に類似した極性指数を持つ非極性溶媒です。しかし、ヘプタンとは異なり、CO₂ は 4 重極モーメントが 0 ではなく（-13·4 ± 0·4×10 ^～ 40 C m²）、アセトニトリル（極性指数 = 5.8）やメタノール（極性指数 = 5.1）などの高極性有機溶媒と完全に混和します。水（極性指数 = 10.2）との混和性はほとんどありませんが、かなりの割合の水を含むメタノール/水、イソプロパノール/水、またはアセトニトリル/水の混合液と混和します。このような幅広い混和性により、CC 移動相は、NPLC 移動相や RPLC 移動相よりも広範囲にわたって極性を拡張できます。表 1 は、RPLC、NPLC、CC で使用される溶媒の溶離力（溶出強度）の値と極性指数をまとめたものです。

表 1 からわかるように、RPLC の水ベースの移動相には限られた範囲の溶離系列しか使用できません。これはほとんどのその他の有機溶媒に対する水の混和性が限られているためです。NPLC でも同様に、ヘキサンやヘプタンがベースの移動相では、非極性有機溶媒の高極性溶媒との混和性が限られているため、幅広い溶離系列を使用できません。また、NPLC の別の問題として、すべての有機溶媒が互いに幅広く混和できるわけではないため、一部の混合液は不適合になります。一方、CC の場合、圧縮 CO₂ はすべての溶離系列にわたってすべての溶媒と混和できるため、分離の選択性に影響を与える移動相の選択の幅が広がります（表 1 を参照）。CO₂ は非極性ですが、CC は NPLC と比べるとはるかに広い溶離度に対応できるため、特に高極性側では RPLC と同等です。例えば、CO₂ をメタノールと組み合わせると、移動相の溶離強度は 0 ～ 0.73E^o にプログラムできます。

CC の CO₂ ベースの移動相は、溶離度範囲の拡張に伴って、非常に多くの固定相ケミストリーに適合します。表 2 に、NPLC と RPLC で一般的に使用される移動相を記載します。ほとんどの RPLC 分離は C₁₈ 固定相を用いて行われ、その他の結合相が使用されることはあまりありません。リストにある固定相の一部は、高極性であるため、RPLC では使用できません。NPLC と同様、カラムの選択は移動相の極性範囲の制約を受けます。CC では、極性範囲が広いため、これらすべてのカラムケミストリーの選択が可能で、選択性の幅が広がります。（図 4 を参照）。West および Lesellier が指摘したように、これらすべてのケミストリーは、同じ移動相組成で使用することができるため、極性が非常に異なるカラムを組み合わせるという興味深い可能性が開かれます。

CO₂  の混和性が重要である別の理由として、CC が幅広いサンプル希釈液（サンプルを溶解したり希釈したりする溶媒）に適合するという点が挙げられます。CC のこの特性は、ラボの全体的なワークフローに大きな影響を与えます。多くの場合、クロマトグラフィーラボの最大のボトルネックはサンプル前処理です。ほとんどの一般的なサンプル前処理法では、使用する LCシステムに適合しない溶媒に目的の分析種を溶解することになります。例えば、多くの分析種は有機溶媒に簡単に溶解するため、有機溶媒による抽出で最良の結果が得られます。高濃度の有機溶媒は RPLC に適合しないため、多くの場合、有機溶媒を RPLC に適合する溶媒に変換する追加のステップが必要になります（図 5）。CC では、有機溶媒に溶解したサンプルを直接注入することができるため、逆相分離で必要な非常に時間がかかる有機溶媒を蒸発させるステップやサンプルを水ベースの希釈液に再溶解するステップが不要になります。その結果、分析全体で大幅なコスト削減になります。さらに、分析時間も大幅に短縮できます。これらを合わせると、特に膨大な数のサンプルを分析するために複数の RPLC システムを使用しているラボにとって非常に大きな影響となります。

つまり、非極性の圧縮 CO₂ を溶離力の範囲が両極端の共溶媒と組み合わせ、CC に適合する多様な固定相と組み合わせることで、非常に広い選択性の範囲が得られ、CC をさまざまな分離の課題に適用することが可能になります。

CO2 の輸送特性

CC の特性の利点として粘性が低いことも挙げられ、結果として CC 移動相における分析種分子の拡散性が高まります。物理的特性の観点から、クロマトグラフィーカラムの効率は、移動相中における分析種の拡散性に左右されます。分子の拡散性が大きいほど、固定相粒子のポアを出入りする速度が速くなり、移動相の速度が速くても高い効率が得られます。CC では、多量の液体モディファイヤー（例：CO₂/メタノール（70/30、mol/mol %））を添加した後でも、移動相の粘度は LC 移動相の粘度の半分です（表 3 を参照）。つまり、CC では、はるかに速い移動相流速でも、カラム効率を犠牲にすることなく分析を行えます。これにより、CC はハイスループット分析の有望な候補となります。

高速キラルスクリーニングおよびアキラル分離用の順相クロマトグラフィーの代替という主要な 2 つのアプリケーション分野における CC の利点は非常に大きなものです。キラルスクリーニングにおいて、分析時間が 20 分からわずか 3 分と 7 分の 1 に短縮し、分離能も向上しました。この向上は、NPLC では不可能であった溶媒グラジエントを CC に採用したことによります。溶媒消費量が少なく、それによりもたらされる大幅なコスト削減も CC の利点です。

順相の有機溶媒を主に圧縮 CO₂ で構成される移動相に置き換えることにより（図 6）、1 サンプル分析あたり約 6 ドルであったコストがわずか 5 セントに削減されます。分析時間の短縮および溶媒の購入費や廃棄費の削減による全体的な財政面での影響は計り知れません。

その他の有益な特性の役割

表 4 に、LC 移動相に対する CC 移動相の利点をまとめます。混和性や低粘性といった利点に続いて、表面張力が低いという利点もあります。表面張力が低いことで、移動相が固定相粒子のポアにより速やかに入ることができるため、カラム平衡化に要する時間が短縮します。

CC が非常に魅力的なクロマトグラフィーシステムとなる CO₂ の別の特性として、安さと取り扱いの安全さ、そして持続可能である点が挙げられます。CO₂ は容易に入手でき、他の重要なプロセス（石油化学産業などの副産物であるアセトニトリル）に依存しません。市販グレードの CO₂ はカーボンニュートラルであり、環境にやさしい溶媒と見なされています。CO₂ は、他の有機溶媒と比べてかなり安価で、廃棄の費用もかからず（リサイクルをしない場合）、大気中に直接排出できます。

また、CO₂ は不燃性で毒性がなく、保管も容易です。CO₂ のような混和性と低粘性を併せ持ち、CO₂ ほど経済的で環境にやさしい移動相を見つけることは不可能です。これらのことから、多くのアプリケーションにおいて、LC に対する CC の 優位性は明らかです。表 4 にリストしたこれらすべての特性が合わさることにより、CO₂ に代わる溶媒はありません。

超臨界か否か

前述の通り、クロマトグラフィーの観点からは、CC において、移動相が超臨界であるかそうでないかは問題ではありません。しかし、クロマトグラフィー分離を実施するには、CC 移動相が均一であり、ガスと液体の不均一な混合物ではないということが絶対に必要です。均一性を確保するため、CC の移動相は一定の圧力より高く維持する必要がありますが、これは自動背圧レギュレーター（ABPR）で簡単に設定できます。