氨基酸水解和分析综合指南

尽管本指南大体上集中在氨基酸分析的初始步骤（重点在水解样品制备），但本节还是简要讨论了氨基酸分析中更常用的定量方法。在这些示例中，我们获得了氨基酸分析结果；分析中需要计算原始样品浓度。在这些示例中，我们假设已使用AccQ•Tag或AccQ•Fluor试剂进行了衍生化处理。

在进行定量之前：

• 验证是否已正确鉴别所有峰。
• 如果保留时间不匹配，请检查校正表中的值。
• 检查所有峰的积分是否正确。

在某些分析中，分析目标只是测定分析样品的浓度。测定结果通常以摩尔浓度表示，例如µmol/L。色谱结果通常以皮摩尔为单位。要测定浓度，请将色谱软件报告的氨基酸皮摩尔量除以进样体积，然后将该值乘以稀释剂体积，再除以衍生化体积。将该值乘以稀释因子，然后将单位换算为µmol/L，计算完成。

计算示例：
要确定原始样品中氨基酸的浓度，请将报告的值用于以下公式：

其中：

pmol AA = 样品中氨基酸的报告量

Vi = 进样体积(µL)，通常为1 µL

Vd = 衍生化体积(µL)，通常为10 µL

Vr = 用于复溶样品的稀释剂的体积(µL)

Dil. Factor = 稀释因子

示例：

将初始的100 µL水解蛋白质样品用内标按1:1稀释。将10 µL等分试样进行衍生化处理。进样体积为1 µL，天冬酰胺(Asn)的报告值为312.5 pmol。

Asn的浓度(µmol/L)为：

水解蛋白质中氨基酸组分的测定涉及样品中组分摩尔比的计算。

每种纯蛋白质对其中包含的每种氨基酸均具有特定的残基化学计量数。理想情况下，分析结果得到的摩尔比为整数。观测值接近该理想值的程度受蛋白质或肽的纯度、水解条件是否充分，以及氨基酸分析质量的影响。

示例1（如下表所示）：

1. 将各氨基酸的观测皮摩尔量（从分析中获得）列成表格。
2. 检查并估算各氨基酸的残基数（估算组分）。注意：观察到的残基是每种氨基酸的相对摩尔浓度。将所有观测皮摩尔值除以丰度最低的氨基酸摩尔量，并四舍五入到最接近的数字。
3. 将所有氨基酸的皮摩尔值和残基数相加。
4. 将观测总皮摩尔数除以估算组分的总和来计算每个残基的平均pmol（pmol/残基）。
5. 将每个观测皮摩尔值除以pmol/残基值以确定观测组分。

警告：对于较大的蛋白质，由于需要更高的精度，因此更难以估算残基数。

警告：某些氨基酸的水解回收率可能会变化（Ser、Tor、Tyr和Met会降解；Val和Ile键可能难以断裂）。

注：为了在这类情况下改善定量，建议进行时程研究。通常，可将样品水解24 h、48 h和72 h（或96 h）；不稳定的氨基酸值可通过外推回零时间来确定，而Ile和Val的值可从时间最长的水解中获得。

示例2：
在一些情况下，如前所述，可以使用摩尔百分比（每100个蛋白质残基中各氨基酸的残基数）计算结果。测定方法如下：

如果可以估算蛋白质的分子量，则可以使用两种方法来计算大致组分：

1. 估算的样品分子量(MW)。
2. 将氨基酸的总产物量相加(pmol)。
3. 将分子量除以110（氨基酸的平均分子量）。注：由此可计算得出非常接近总链长或氨基酸总量的值。
4. 将总产物量除以链长（等于进样的摩尔量）。
5. 将每种氨基酸的量除以进样的摩尔量（等于每摩尔的残基数）。检查该值与整数量的偏差。
6. 稍微向上或向下调整除数（进样的摩尔量），尽可能减小与整数值（步骤5中获得）的偏差。可利用计算机电子表格程序或专属定制的氨基酸软件找出最小偏差，简化该步骤。
7. 请记住，由于水解回收率低，不稳定的氨基酸和稳定键合形成物的值可能会显著偏离整数值。

这种替代方法需要有关样品的更多知识。

1. 在分析中选择满足以下两项标准的氨基酸：
   • 在水解和衍生化时产率高（例如，Asp、Glu、His、Arg、Ala、Pro、Leu、Phe、Lys）。不建议选择Gly，因为它是一种常见的背景污染物；
   • 每摩尔样品可能仅含有几个残基（基于估算的样品分子量和氨基酸产量）。这些信息可以从其他方法中获得，例如溴化氰水解，溴化氰可在蛋氨酸处选择性地切割完整的多肽链。
2. 基于这些信息，为该氨基酸选择一个整数值。
3. 将所选氨基酸的产量除以所选整数值，即可得到估算的进样摩尔量。
4. 按照第7.3.2.1节步骤5和6操作。
5. 检查得出的值（一个小于和一个大于所选整数的值），确定它们与整数的偏差是否减小。

将每个氨基酸的皮摩尔数与其相应的分子量的乘积相加，计算原始样品中肽或蛋白质的浓度。

使用第7.3.1节表格中引用的示例，开始按照以下方法计算：

计算示例：

对于样品中的Asp（天冬酰胺）：分子量为133.10 g/moL的氨基酸的观测含量为220皮摩尔，如下所示：

对于其他所需的氨基酸，该计算方法也适用。下表显示了计算得出的每种氨基酸的皮克数值，右下角显示了样品中进样的蛋白质的皮克数值总和。

在食品和饲料分析中，上述计算值也适用。然而，对大多数饲料分析而言，更重要的信息是一些特定的、限制动物生长的氨基酸（例如蛋氨酸和半胱氨酸）含量。最常引起关注的值是样品中的氨基酸含量（重量百分比）。

要计算氨基酸的重量百分比：

计算示例：

报告的含量值(pmol/µL)须乘以残基分子量(gm/mol)和换算系数。

然后将报告的含量(g/mol)乘以稀释因子。再将结果除以样品的重量并乘以100，即可换算为重量百分比。

计算示例：

其中：

    含量 = 氨基酸的含量，g/mL

    稀释因子 = 样品稀释因子

样品重量以mg为单位

该方法需要使用内标。

计算示例：

将内标的峰面积乘以氨基酸的重量(mg)。然后将计算值除以氨基酸峰面积与内标重量相乘的值。

其中：

    RF_aa = 氨基酸的响应因子

    P_n = 内标的峰面积

    P_aa = 样品中氨基酸的峰面积

    W_aa = 氨基酸重量(mg)

    W_n = 内标重量(mg)

开始计算含量百分比：将氨基酸峰面积乘以计算出的响应因子，然后将该值乘以内标因子。将结果除以内标峰面积和分析样品重量的被乘数。然后将结果值换算为百分比。

其中：

    P_aa = 氨基酸峰面积

    P_n = 内标峰面积

    RF_aa = 计算出的响应因子

    IS = 计算出的内标因子

示例：

对于饲料样品中的氨基酸，已确定以下值：

    氨基酸重量(W_aa) = 0.5 mg

    氨基酸峰面积(P_aa) = 100,000

    内标峰面积(P_n) = 110,000

    内标重量(W_n) = 0.5 mg

    待测样品的重量(W_s) = 10 mg

0.5 mg × 2 × 10-2 = 0.05

在饲料中，目标氨基酸的重量百分比为0.9%。