氨基酸水解和分析综合指南

肽和蛋白质由通过肽键结合在一起的许多氨基酸组成。这些生物分子继而构成许多不同的样品，诸如生物治疗药物、食品和饲料。为分析这些生物分子中所包含的氨基酸，使键水解以形成游离氨基酸至关重要。但在该过程中，偶联氨基酸键的不同化学性质可能影响氨基酸键的裂解效率以及单个氨基酸的回收率。例如，水解过程中氨基酸的回收率会受到特定化学反应、试剂基质干扰物和氨基酸本身稳定性的影响。

鉴于样品和氨基酸的化学及物理性质存在很大差异，多年来已经开发出不同的水解程序。这些程序因反应类型（化学或酶促反应）、化学反应的性质（酸或碱）和反应的物理状态（液相或气相）而异。这些差异会影响特定氨基酸（可能被特定试剂破坏）的回收率或水解所需的效率和时间。在一些情况下，可能需要采用多种水解程序以确定样品的总氨基酸含量。常见的化学水解反应类型和水解模式如下所述。

注：酶水解是一种不常用的程序，本文档未作介绍。

还需注意的是，许多化学水解反应可以使用不同类型的设备进行。过去，水解程序在真空下使用热源以确保反应完成，但随着更现代化的设备推出，微波诱导水解也得到了广泛应用。每种方法的优势各不相同，应当在选择设备之前加以考察。

1.1.1 酸水解

酸水解是水解蛋白质样品的最常用方法，该方法可以在气相或液相中进行。尽管该反应可以使用一系列不同的酸，但最常用的是6 M盐酸。由于盐酸具有蒸发性，也可以用于回收少量缓冲液中的水解产物，处理少量样品时这一特性非常有用。此外，盐酸的通用性使其可用于液相或气相水解。

采用6 M盐酸的酸水解反应导致向每个共价肽键中添加水，从而得到所需的单个氨基酸（图1）。但是，并非所有氨基酸在盐酸水解下都能完全回收。一些氨基酸会水解为酸形式：例如天冬酰胺和谷氨酰胺分别形成天冬氨酸和谷氨酸。此外，其他氨基酸无法得到可靠的测量。例如，色氨酸在反应过程中被破坏，而含硫氨基酸（例如，半胱氨酸、蛋氨酸）由于氨基酸被部分破坏而无法得到可靠的测量。此外，由于酸水解的性质，酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸等氨基酸的回收率可能较低。

但是，如果经过预处理，一些含硫氨基酸（例如，半胱氨酸、蛋氨酸）可以在用盐酸酸水解时得以保留。为准确定量分析这些氨基酸，可以在用盐酸酸水解之前对样品进行氧化或烷基化。对于氧化，在用盐酸酸水解之前，通常用过甲酸将含硫氨基酸氧化。由此导致这些氨基酸的氧化形式得到准确定量。也可以通过烷基化保留含硫氨基酸（半胱氨酸），从而准确定量其烷基化形式。两种最常用的烷基化试剂产生两种形式的半胱氨酸，即吡啶乙基半胱氨酸或羧甲基半胱氨酸。这种烷基化过程的另一个优势在于它不影响其他氨基酸。

最后，鉴于利用盐酸水解难以定量分析某些氨基酸，针对特定氨基酸可采用替代酸水解技术。一种技术使用磺酸（例如甲磺酸(MSA)）来定量分析色氨酸和蛋氨酸（呈亚砜的形式）。虽然这种试剂是非挥发性的，但它能够保留色氨酸和蛋氨酸亚砜以进行定量。

1.1.2 碱水解

虽然用盐酸酸水解是迄今为止十分常用的水解蛋白质和肽的技术，但色氨酸的测量通常使用碱水解。由于色氨酸在碱性条件下保持稳定，因此该技术可准确定量色氨酸，并且广泛用于从食品和饲料到肽和蛋白质的各种样品。碱水解通常使用NaOH或KOH作为试剂。但是，碱水解不能代替酸水解来定量分析所有氨基酸。在碱性条件下，精氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸被破坏，无法定量。其他氨基酸也受到影响，因此碱水解通常仅用于色氨酸。

水解反应在液相或气相中进行。无论采用哪种水解模式，专门设计用于水解的仪器都将促进反应。过去，许多水解反应在高温和真空下进行数小时至数天，但是随着微波水解仪器的出现，相同的过程在较低温度下只需数分钟即可完成。

1.2.1 液相水解

在液相水解中，样品和盐酸都直接加入水解管中进行反应。该程序需要将样品、内标和酸直接加入水解管中。将水解管用氮气冲洗，然后密封并在完成水解所需的时间内持续加热。液相水解可能需要数小时到数天才能完成。该程序通常用于较复杂的样品。

1.2.2 气相水解

在气相水解中，样品仅与气相盐酸发生反应。该程序需要将样品和内标（如果使用）放入水解管中。然后将样品干燥，并将每个试管敞开放入水解容器中。将酸（6 M盐酸）加入装有水解管的容器底部，然后将容器密封并抽真空，再用氮气冲洗。在完成水解所需的时间内持续加热容器。该模式减少了来自任何不纯试剂（例如盐酸）的污染。气相水解通常以快于液相水解的速率发生。在气相水解中，通常需要样品具有高纯度。