液相色谱初学者指南

在图H中，三种染料化合物表示为在色谱图的不同时间分离的三个峰。它们各自在特定位置洗脱，通过在进样时刻[时间零]与峰最大值洗脱时间之间所经过的时间来衡量测量。通过对每个峰的保留时间[t_R]与在同一色谱系统[采用相同的流动相和固定相]中进样分析的参比标准品的结果进行比较，色谱工作者或许能够鉴定每种化合物。

在图I-1所示的色谱图中，色谱工作者知道，在这些LC系统条件下，分析物丙烯酰胺将在2.85分钟[保留时间]时从色谱柱中分离和洗脱。每当在相同条件下将恰好包含丙烯酰胺的新样品进样至LC系统时，就会在2.85分钟处出现一个峰[见图I-2中的样品B]。

[为更好地理解为什么某些化合物比其他化合物移动得更慢[更好地保留]，请查看HPLC分离模式]。

一旦鉴定完成，下一条重要信息就是样品中存在的各种化合物的量。我们可以通过检测器得到的色谱图及相关数据计算各种化合物的浓度。当化合物谱带通过流通池时，检测器的响应基本取决于化合物谱带的浓度。浓度越高，信号越强；其表现为高于基线的峰高越高。

在图I-2中，样品A和B的色谱图在同一时间尺度上彼此叠加。两次运行中的进样体积相同。两幅色谱图均在保留时间[t_R] 2.85分钟处显示一个峰，表明每个样品都包含丙烯酰胺。然而，样品A显示的丙烯酰胺峰要大得多。峰下面积[峰面积计数]是其所代表的化合物浓度的量度。该面积值由计算机数据工作站自动积分并计算。在本例中，样品A中丙烯酰胺的峰面积是样品B中峰面积的10倍。使用参比标准品，可以确定样品A包含10皮克丙烯酰胺，是样品B中丙烯酰胺的10倍[1皮克]。请注意，两个样品中都有在1.8分钟时洗脱的另一个峰[未得到鉴定]。由于两个样品中该峰的面积计数大致相同，因此该未知化合物在两个样品中的浓度可能相同。

等度和梯度LC系统操作

HPLC使用两种基本的洗脱模式。第一种称为“等度洗脱”。在该模式下，流动相（纯溶剂或混合物）在整个运行过程中保持不变。典型系统见图J-1。

第二种称为“梯度洗脱”，顾名思义，流动相组分在分离过程中改变。该模式适用于包含广泛色谱极性化合物的样品[参见“HPLC分离模式”章节]。随着分离的进行，流动相的洗脱强度增加，以洗脱保留性更强的样品组分。

在最简单的情况下，如图J-2所示，采用两瓶溶剂和两个泵。梯度控制器将控制每个泵的速度，以便在分离过程中控制每种溶剂的输送量。两种液流在混合器中混合，形成实际的流动相组成，并在一段时间后输送至色谱柱。一开始，流动相中包含较高比例的弱溶剂[溶剂A]。随着时间的推移，强溶剂[溶剂B]的比例将根据预定的时间表增加。请注意，在图J-2中，混合器位于泵的下游；这导致在高压下形成梯度。其他HPLC系统用于在单个泵之前在低压下混合多种溶剂流。梯度比例阀从四个溶剂瓶中选择一个，随时间推移而改变流动相的强度[见图J-3]。

HPLC规模[分析型、制备型和工艺型]

我们已经讨论了HPLC如何提供可用于鉴定和定量分析样品中化合物的分析数据。然而，HPLC也可以使用检测器流通池下游的馏分收集器，按照所需的量纯化和收集各种化合物。该过程称为制备型色谱[见图K]。

在制备型色谱中，科学家能够收集从色谱柱中洗脱出来的单个分析物[例如，在本例中依次为黄色、红色和蓝色]。

馏分收集器在指定的时间段内选择性收集当前包含经纯化的分析物的洗脱液。移动容器以使每个容器只收集一个分析物峰。

科学家确定纯度水平和含量的目标。结合考虑有关样品复杂性以及所需分析物相对于基质成分的性质和浓度的了解，通过这些目标倒推需要处理的样品量以及HPLC系统所需的容量。一般来说，样品量越大，所需的HPLC色谱柱尺寸越大，并且泵需要更高的体积-流速容量。确定HPLC系统容量的过程称为选择HPLC规模。表A列出了各种HPLC规模及其色谱目标。

使用HPLC固定相与流动相的特定组合尽量提高选择性的能力（即在两种目标样品组分之间尽量实现更高分离度）对于确定放大分离的要求至关重要[参见有关“HPLC分离模式”的讨论]。然后，容量取决于将柱体积[V_c]缩放至待进样的样品量并选择合适的粒径[确定压力和柱效；参见有关“分离能力”的讨论]。柱体积是柱床长度[L]和内径[i.d.]的函数，决定了可以包含的填料[颗粒]的量（见图L）。

一般来说，HPLC色谱柱的长度[L]为20 mm~500 mm，内径[i.d.]为1 mm~100 mm。随着色谱规模的增加，色谱柱尺寸（尤其是截面面积）也随之增加。为优化通量，流动相流速必须与截面面积成比例增加。如果需要以更小的粒径获得更高的分离能力，则泵必须设计为在高柱压下维持更高的流动相体积流速。表B列出了一些有关选择色谱柱内径的简单指南，以及建议用于各种色谱规模的粒径范围。

例如，半制备级应用[红色X]将使用内径为10~40 mm且填充5~15微米颗粒的色谱柱。然后可以根据每次运行期间需要处理的纯化化合物的量以及所需的分离能力来计算柱长。