液相色谱初学者指南

一般来说，可以利用化合物的三种主要特性来实现HPLC分离。它们是：

• 极性
• 电荷
• 分子大小

首先，我们介绍极性以及利用这一特性的两种主要的分离模式：正相色谱和反相色谱。

基于极性的分离

分子的结构、活性和理化特性由其组成原子的排列以及它们之间的键决定。在分子内，引起特殊性质和可预测的化学反应的某些原子的特定排列被称为官能团。这种结构往往决定了分子是极性的还是非极性的。有机分子根据其各自包含的主要官能团分类。对于基于极性的分离模式，不同种类分子的相对色谱保留在很大程度上取决于这些官能团的性质和位置。如图P所示，可按照分子的相对保留，在从强极性到强非极性的色谱极性范围或系列中对分子种类排序。

水[一种具有高偶极矩的小分子]是一种极性化合物。苯[一种芳香烃]是一种非极性化合物。具有相似色谱极性的分子往往会相互吸引；那些具有不同极性的分子表现出的吸引力弱得多（如果有的话），甚至可能相互排斥。这是基于极性的色谱分离模式的基础。

还可以通过熟悉的类比来理解这一模式，即油[非极性]与水[极性]无法混合。与异极相互吸引的磁力不同，基于极性的色谱分离取决于同类极性之间较强的吸引力以及相反极性之间较弱的吸引力。请记住，在基于极性的色谱法中，“同类相吸”。

为设计一套色谱分离系统[见图Q]，我们通过选择具有不同极性的流动相和固定相，使样品中包含的各种化合物之间形成竞争。然后，样品中与固定相[色谱柱填料]极性相似的化合物的洗脱时间将被延迟，因为它们更强烈地被颗粒吸引。极性与流动相相近的化合物将优先被流动相吸引，因此移动速度更快。

通过这种方式，基于各种化合物对各相的相对吸引力的差异，通过改变分析物的速度来实现分离。

图R-1、R-2和R-3分别显示了流动相、固定相和样品分析物的典型色谱极性范围。接下来依次介绍它们，了解色谱工作者如何选择适当的相来开发必要的吸引力竞争以实现基于极性的HPLC分离。

如图R-1所示，一些常用溶剂按相对色谱极性排列的标度被称为“洗脱序”。流动相分子将与分析物分子有效竞争有吸引力的固定相位点并置换这些分析物，使它们更快速地通过色谱柱[弱保留]。水处于流动相-溶剂标度的极性端，而脂肪烃己烷则处于非极性端。在这两者之间，可以按照洗脱强度的顺序排列单一溶剂以及混溶溶剂混合物[按适用于特定分离要求的比例混合]。标度的哪一端代表“高强度”流动相，取决于发生分析物分子竞争的固定相表面的性质。

硅胶具有活性、亲水性[亲水]表面，并且含有酸性硅醇[含有硅的醇类似物]官能团。因此，硅胶落在图R-2所示的固定相标度的极性端。可通过化学键合至极性较低的官能团[键合相]来选择性地改变硅胶表面的活性或极性。本文显示的示例包括（按极性递减的顺序）硅胶上的氰基丙基甲硅烷基- [CN]、正辛基甲硅烷基- [C₈]和正十八烷基甲硅烷基- [C₁₈, ODS]部分。后者是一种疏水[憎水]的非极性极强的填料。

图R-3重复展示了样品的色谱极性谱[如图P所示]。在考虑了两相的极性之后，对于给定的固定相，色谱工作者必须选择一种流动相，在该流动相中可以保留目标分析物，但保留性又不能强到无法洗脱。色谱工作者可以在强度相似的溶剂中选择适当的相组合，充分利用分析物极性和溶解度的更细微的差异，从而尽量提高色谱系统的选择性。同类相吸，但是正如您可能从目前的讨论中所设想的那样，创建基于极性的分离涉及对样品的了解以及有关各种分析物和保留模式的经验。综上所述，色谱工作者将选择具有适当相反极性的流动相与颗粒固定相的理想组合。然后，随着样品分析物通过色谱柱，同类相吸的规则将决定哪些分析物速度减慢，哪些分析物以更快的速度前进。

正相HPLC

Tswett使用极性固定相[玻璃柱中的白垩；见图A]与极性小得多的[非极性]流动相，成功地分离了植物提取物。这种经典的色谱模式被称为正相色谱。

图S-1展示了三染料测试混合物的正相色谱分离结果。固定相是极性的，对极性黄色染料有强保留性。流动相（一种非极性溶剂）在保留竞争中赢得相对非极性的蓝色染料，其洗脱速度快。由于蓝色染料更接近流动相[两者都是非极性的]，因此其移动速度更快。硅胶正相色谱的典型流动相是100%有机相；不使用水。

反相HPLC

术语“反相”描述了与正相色谱正好相反的色谱模式，即极性流动相和非极性[疏水]固定相。图S-2展示了使用这种方案对黑色三染料混合物的分离。

其中非极性蓝色染料的保留性更强，因为它对非极性固定相的吸引力更大。保留性较弱的极性黄色染料在极性水性流动相的吸引作用下快速穿过柱床，以同类相吸的方式先洗脱出来。

目前，由于反相色谱具有较高的重现性和广泛的适用性，因此应用于大约75%的HPLC方法中。这些方案大多使用水与可混溶的极性有机溶剂（例如乙腈或甲醇）的水性混合物作为流动相。这通常可以确保分析物与非极性疏水颗粒表面之间具有适当的相互作用。C₁₈键合硅胶[有时称为ODS]是最常用的反相HPLC填料类型。

表C总结了基于极性的两种主要HPLC分离模式的相特性。请记住，对于这些基于极性的模式，同类相吸。

亲水作用色谱[HILIC]

HILIC可以看作是正相色谱的一种变体。在正相色谱中，流动相是100%有机相。流动相和极性填料颗粒的孔隙中仅存在痕量水。极性分析物与极性固定相牢固结合，可能无法洗脱。

在有机流动相[通常是一种非质子溶剂，如乙腈]中添加一定量的水[<20%]，可以分离和洗脱在正相模式中强保留[或在反相模式中弱保留]的极性化合物。水是一种极性很强的溶剂，可以与极性分析物有效地竞争固定相。HILIC可以在等度或梯度洗脱模式下运行。随着流动相极性[强度]的增加[通过添加更多的水]，可以将之前被极性填料颗粒吸引的极性化合物洗脱。分析物按照亲水性[相对于水的色谱极性]增加的顺序洗脱。可以将缓冲液或盐添加至流动相中，以使可电离分析物保持单一形态。

疏水作用色谱[HIC]

HIC是一种反相色谱，用于分离生物大分子，例如蛋白质。这些分子通常希望在水溶液中保持完整性，避免与可能导致变性的有机溶剂或表面接触。HIC利用大分子与中等疏水性固定相的疏水相互作用，例如丁基键合[C₄]，而非十八烷基键合[C₁₈]硅胶。起初，水中较高的盐浓度将促使蛋白质保留在填料上[盐析]。梯度分离通常通过降低盐浓度来运行。通过这种方式，生物分子按照疏水性增加的顺序被洗脱。

基于电荷的分离：离子交换色谱[IEC]

对于基于极性的分离，同类相吸，极性相反时则相斥。在离子交换色谱及其他基于电荷的分离中，规则相反。同类相斥，而相反时则互相吸引。用于离子交换分离的固定相的特征在于其表面酸性或碱性官能团的性质和强度以及它们吸引和保留的离子类型。阳离子交换用于在阴离子表面上保留和分离带正电荷的离子。相反，阴离子交换用于在阳离子表面上保留和分离带负电荷的离子[见图T]。对于各种类型的离子交换，至少有两种通用的分离和洗脱方法。

强离子交换剂带有始终离子化的官能团[例如，季胺或磺酸]。它们通常用于保留和分离弱离子。我们可以使用含有更强烈地被固定相位点吸引的离子的流动相，通过置换将这些弱离子洗脱。或者，我们可以将弱离子保留在色谱柱上，然后通过原位改变流动相的pH中和弱离子，导致其失去吸引力并被洗脱。

弱离子交换剂[例如，带有仲胺或羧酸官能团]可能在高于或低于某个pH值时被中和，并失去其通过电荷保留离子的能力。当带电荷时，它们被用于保留和分离强离子。如果这些离子无法通过置换而洗脱，则可以通过中和固定相交换位点以切断离子吸引力，从而使带电荷的分析物被洗脱。

当弱离子交换剂被中和时，它们可能通过疏水[反相]或亲水[正相]相互作用保留和分离物质；在这些情况下，洗脱强度取决于流动相的极性[图R-1]。因此，弱离子交换剂可用于混合模式分离[基于极性和电荷的分离]。

表D概述了离子交换主要类别的指南。例如，为保留强碱性分析物[始终带正电荷]，请使用pH > 7的弱阳离子交换固定相颗粒；由此保证颗粒表面带负电荷。为释放或洗脱强碱，请将流动相的pH降至3以下；由此去除表面电荷并切断离子交换保留机制。

请注意，pK_a是50%的官能团被电离且50%为中性时的pH值。为确保得到基本中性或完全带电荷的分析物或颗粒表面，必须将pH值调节至比pK_a高至少2个单位的值（视情况而定）[如表D所示]。

不得使用强阳离子交换剂来保留强碱；两者都保持带电状态并相互强烈吸引，此时碱几乎不可能洗脱。这只能通过用竞争性碱取代强阳离子交换剂来去除，这种竞争性碱表现出更强的保留性并通过赢得对活性交换位点的竞争来取代目标化合物。这种方法在HPLC和SPE中的可行性和安全性均较低。[极强酸和极强碱可能会腐蚀用于HPLC流路的结构材料，危险性高，应谨慎使用！]

基于体积的分离：体积排阻色谱[SEC] – 凝胶渗透色谱[GPC]

20世纪50年代，Porath和Flodin发现可以根据大小而不是电荷或极性来分离生物分子，方法是让它们通过孔隙率受控的亲水性葡聚糖聚合物或用此类聚合物对其进行过滤。该过程被称为凝胶过滤。后来，类似的方案被用于使用具有特定孔径范围的有机聚合物填料分离合成低聚物和聚合物。该过程被称为凝胶渗透色谱[GPC]。使用孔隙率受控的硅胶填料所进行的类似的分离被称为体积排阻色谱[SEC]。1963年推出的一款商用HPLC仪器专为GPC应用而设计[见参考文献3]。

通常情况下，这些技术均使用合成固定相，这些固定相的孔径分布范围允许目标分析物或多或少地进入填料的孔体积或从中排除。较小的分子在通过柱床时会穿透更多的孔隙。较大的分子可能只能穿透特定尺寸以上的孔隙，因此它们在柱床上的停留时间较短。巨大的分子可能完全被排除在孔隙之外，只在颗粒之间通过，以小体积非常快速地洗脱。选择流动相的依据有两个：首先，它们是分析物的良好溶剂；其次，它们可以防止分析物与固定相表面之间发生任何相互作用[基于极性或电荷]。通过这种方式，较大的分子先洗脱，而较小的分子移动较慢[因为它们进出更多的孔隙]并较晚洗脱，洗脱顺序遵循它们在溶液中的体积递减的顺序。简言之就是：大者先出。

GPC可以将聚合物的分子量与其在溶液中的体积关联起来，并因此彻底改变了测量聚合物分子量分布从而确定可能影响聚合物加工质量和性能的物理特征的方法[区分聚合物质量好坏的方法]。

结论

希望您喜欢这篇关于HPLC的简介。建议您阅读参考文献并学习有关HPLC术语的附录。