液相色谱初学者指南

氧化铝

使用一种多孔、颗粒状氧化铝[Al₂0₃]作为正相吸附色谱中的固定相。氧化铝具有高活性的碱性表面；10%水性浆液的pH约为10。继续用强酸清洗，可制成中性和酸性级浆液[pH分别为7.5和4]。氧化铝的吸湿性高于二氧化硅。其活度根据Brockmann†级含水量进行判定；例如，活度I级包含1%的水。

†H. Brockmann and H. Schodder, Ber.74: 73 (1941).

基线*

记录当仅有流动相从色谱柱中流出时检测器响应的色谱图部分。

小柱

一种不带末端接头的色谱柱，仅由一个开放管路组成，其中填料被两端筛板保留。SPE小柱可以在真空萃取装置上并行使用。HPLC小柱放置在小柱卡套中，该小柱卡套的每一端都有流路连接。与带有一体式末端接头的传统色谱柱相比，小柱易于更换、成本更低且使用更方便。

色谱图*

检测器响应或洗脱液中分析物浓度的其他量度相对于洗脱液体积或洗脱时间所作的图或其他表示。在平面色谱[例如，薄层色谱或纸色谱]中，色谱图可以表示包含分离区域的纸或薄层。

色谱*

一种动态物理化学分离方法，待分离组分被分配到两相中，其中一相静止[固定相]，另一相[流动相]相对于固定相流动。

柱体积* [Vc]

管路部分的几何体积，包含填料[管路的内横截面积乘以填充床长度L]。色谱柱的颗粒间体积，又称柱隙体积，是填充床中颗粒间流动相所占据的体积。死体积[V₀]是流动相占据的总体积，即柱隙体积与颗粒间体积的总和[又称孔隙体积]。

检测器* [请参阅“灵敏度”]

通过测定物理或化学特性（例如紫外/可见光吸光度、折射率差、荧光性或导电率）指示洗脱液组分变化的装置。如果检测器的响应与样品浓度呈线性关系，则使用标准品进行适当校正，可以对组分进行定量。通常，串联使用两种不同类型的检测器是有利的。这种方式有助于获得有关样品分析物的更多确证或具体的信息。某些检测器[例如电化学检测器、质谱检测器]是破坏性的，即它们会导致样品组分发生化学变化。如果这类检测器与非破坏性检测器配合使用，则通常将这类检测器置于流路后方。

显示器

在计算机屏幕上以色谱图的形式记录检测器电响应的装置。高级数据记录系统还使用复杂的算法执行计算，例如，积分获得峰面积、基线扣除、谱图匹配、定量分析组分，以及通过比较标准数据库来鉴定未知物。

柱效[H，请参阅“理论塔板数”、“分离度”、“灵敏度”、“速度”]

样品谱带通过填充床时，色谱柱阻止样品谱带扩散能力的量度。高柱效色谱柱可大幅减小谱带扩散或谱带展宽。高柱效对于实现高效分离、提高灵敏度和/或鉴定复杂混合样品中的相似组分非常重要。

诺贝尔奖获得者Martin和Synge参照蒸馏过程，引入了塔板高度[H或H.E.T.P.，理论塔板高度]的概念，作为色谱柱效的量度以及比较色谱柱性能的一种手段†。他们认识到填料粒径尽可能小且均匀的填充床[需要更高的压力]是提高柱效的关键，为HPLC和UPLC技术的出现奠定了基础。影响谱带展宽的色谱柱与分离系统参数关系式后来通过van Deemter方程进行定义††。

色谱工作者通常将他们可以根据色谱图上的测定值简单、直接计算出来的量（即理论塔板数[N]）称为柱效。然后根据柱床长度与N的比值确定理论塔板高度[H = L/N；根据色谱图计算N的方法如图U所示]。需要注意的是，使用这些方法计算N或H仅适用于等度条件，不能用于梯度分离。

†A.J.P. Martin and R.M. Synge, Biochem.J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg and A. Klinkenberg, Chem.Eng.Sci.5: 271–289 [1956]

洗出液

从色谱柱出口流出的包含溶液中分析物的洗脱液部分。在分析型HPLC中，检测器将测定洗出液中分析物的浓度或质量数。在制备型HPLC中，系统以均匀的时间或体积间隔连续收集等份洗出液，或只在检测器检出目标峰时（不定时）进行收集，然后对这些馏分进行处理，获得纯化合物。

洗脱液

流动相[请参阅“洗脱色谱”]。

洗脱序

根据标准吸附剂上的指定分析物，将溶剂按洗脱强度排序的列表。此类溶剂序列在开发等度和梯度洗脱方法时很有用。Trappe在证明了一系列极性增加的溶剂可以分离氧化铝上的脂质馏分后创造了该术语†。后来，Snyder测定了若干正相LC吸附剂上大量溶剂的溶剂强度参数并将这些参数制成了表格††。Neher绘制了一张非常有用的诺谟图(nomogram)，可以通过该图选择正相溶剂的等洗脱[恒定洗脱强度]混合物来优化TLC分离的选择性†††。

典型的正相洗脱序从弱端的非极性脂肪烃开始，例如戊烷或己烷，然后依次为苯[芳烃]、二氯甲烷[氯代烃]、乙醚、乙酸乙酯[酯]、丙酮[酮]，最后是强端的甲醇[醇][请参阅图R-1]。

†W. Trappe, Biochem.Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], pp.192–197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] pp.75–86.

洗脱* [动词]

利用洗脱色谱法进行色谱分离。洗脱过程可以在所有样品组分仍在色谱柱床上时停止[平面薄层色谱或纸色谱]，或一直持续到组分离开色谱柱床才停止[柱色谱]。

注：为避免与方法开发实践混淆，优选使用术语洗脱而非显色[平面色谱中使用的术语]，其中分离体系[流动相与固定相的组合]将针对特定分离进行优化。

洗脱色谱*

流动相连续通过色谱柱床的色谱分离方法。在HPLC中，一旦检测器基线稳定且分离系统达到平衡，就会将一定的样品引入流动相液流中。洗脱过程将持续到所有目标分析物均已通过检测器。

洗脱强度

溶剂对分析物的亲和力（相较于固定相）的量度。弱溶剂无法置换分析物，导致分析物在固定相上的保留性高。强溶剂可完全置换所有分析物分子，使分析物无保留地通过色谱柱。为适当平衡有效分离与合理的洗脱体积，通常将溶剂混合，以造成两相之间的适当竞争，从而优化给定分析物组的选择性和分离时间[请参阅“选择性”]。

偶极矩、介电常数、氢键、分子大小和形状以及表面张力都可能作为洗脱强度的指标。洗脱强度也由分离模式决定。在吸附或正相条件下，可以通过提高一个方面的强度来排定溶剂的洗脱序；在反相分配条件下，这个顺序可能几乎相反[请参阅图R-1]。

荧光检测器

荧光检测器使用特定波长的光激发样品，使某些化合物发出荧光并发射更高波长的光。传感器设置为特定的发射波长，并被屏蔽，以避免被激发源遮挡，只收集发射的光。通常可以对天然不发荧光的分析物进行衍生化处理，从而利用这种检测形式的高灵敏度和选择性，例如氨基酸的AccQ•Tag衍生化处理。

流速*

单位时间内通过色谱柱的流动相体积。在HPLC系统中，流速由溶剂输送系统[泵]的控制器设置。可通过定时采集和测量色谱柱出口洗脱液来检查流速的准确度。由于溶剂的密度随温度而变化，因此任何校正或流速测定都必须考虑到这个变量。在可能的情况下，需按重量（而非按体积）才能进行更为准确的测定。

流速的均匀性[精度]和重现性对许多LC技术而言都非常重要，尤其是在保留时间对分析物鉴定至关重要的分离中，或是在保留时间的校正和相关性对准确测量聚合物的分子量分布至关重要的凝胶渗透色谱中。

分离条件通常通过线速度（而不是流速）进行比较。线速度计算：用流速除以色谱柱的截面面积。流速以体积/时间[例如，mL/min]表示，线速度则以长度/时间[例如，mm/s]来表示。

凝胶渗透色谱*

分离主要基于分子大小和/或形状差异引起的排阻效应。凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱的固定相为溶胀凝胶。两者都属于体积排阻色谱。Porath和Flodin率先阐述了使用葡聚糖凝胶和水性流动相对生物分子进行体积排阻分离的凝胶过滤法†。Moore在多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物凝胶上使用有机溶剂流动相，应用类似的体积排阻原理进行溶液中有机聚合物的分离††。

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
††J.C. Moore，美国专利3,326,875 [1963年1月提交；1967年6月获得授权]

梯度

由两种（或更多种）可混溶溶剂组分形成相对浓度随时间推移而变化，且洗脱能力不断增强的流动相。分级梯度通常用于固相萃取；在每个梯度，洗脱液组分均从较弱的流动相突然变为更强的流动相。甚至可以在梯度之间使SPE吸附剂床干燥，从一种溶剂改变为另一种不混溶的溶剂。

连续梯度通常由低压或高压混合系统[请参阅图J-2和J-3]根据预先确定的曲线[线性或非线性]生成，曲线显示固定时间段内初始溶剂A中强溶剂B的浓度。可以在连续梯度内的任何时间点对固定等度溶剂组分的保持时间进行设定。分离结束时，也可以将梯度程序设置为返回初始流动相组成，重新平衡色谱柱，以用于下一个样品的进样。复杂的HPLC系统可以将多达四种或更多种溶剂[或溶剂混合物]混合为连续梯度。

进样器[自动进样器，样品管理器]

用于将独立、指定体积的样品溶液精准引入[注入]流动相液流中的装置。进样器可以是简单的手动装置，也可以是复杂的自动进样器，它可以设定为无人值守的方式从一系列单独的样品瓶或孔中按预定的顺序进样多个样品。这些系统中的样品室还可以进行温度控制，从而在数小时的运行中保持样品的完整性。

大多数现代进样器都包含某种规格的注射器填充式样品定量环，样品定量环可通过多端口阀切换为在线或离线状态。进样系统经过精心设计，内部体积很小，位置靠近色谱柱入口，可大幅减小样品的谱带展宽。系统还能够在进样间进行流动相或清洗溶剂冲洗（至废液），避免残留[当前样品被前一个样品污染]。

尽量将样品溶解于将要进样的流动相中，为进样做好准备；这样可以防止分离和/或检测问题。如果必须使用另一种溶剂，该溶剂的洗脱强度需要小于或等于流动相的洗脱强度。通常，明智的做法是将少量样品溶液与流动相离线混合，以测试可能影响成功分离的沉淀或混溶性问题。

入口

色谱柱床末端，流动相液流和样品进入的地方。多孔惰性筛板可保留填料并保护吸附剂床入口免受颗粒物污染。优良HPLC规范要求样品和流动相应不含颗粒物；这对于进样口很容易堵塞的小颗粒色谱柱而言至关重要。如果柱床入口被堵塞并显示出高于正常值的柱压，有时在将流出物引向废液的同时反转液流方向可能可以去除并冲走位于筛板顶部的样品碎屑。如果碎屑已穿透筛板并滞留在柱床本身的入口端，则色谱柱很可能已达到其使用寿命的终点。

离子交换色谱* [请参阅“基于电荷的分离”部分]

该分离模式主要基于样品组分离子交换亲和力的差异。在小颗粒、表面多孔、高效离子交换色谱柱上分离水中或缓冲水性流动相中的主要无机离子物质，然后进行电导或电化学检测，这种方法称为离子色谱[IC]。

等度洗脱*

一种洗脱方法，洗脱过程中流动相组分保持恒定。

液相色谱* [LC]

以液体作为流动相的分离技术。液相色谱可以在色谱柱或平面[TLC或纸色谱]上进行。1970年，利用较小颗粒和较高入口压力的现代液相色谱被称为高效（或高压）液相色谱[HPLC]。2004年，超高效液相色谱将LC的性能大幅提升至一个全新的高度[请参阅“UPLC技术”]。

流动相* [请参阅“洗出液”、“洗脱液”]

按照一定方向沿固定相吸附剂床渗透的流体。流动相可能是液体[液相色谱]或气体[气相色谱]，或超临界流体[超临界流体色谱]。在气相色谱中，可以使用载气表示流动相。在洗脱色谱中，流动相也可以称为洗脱液(eluent)，而洗出液(eluate)一词则定义为已经通过吸附剂床并在溶液中包含目标化合物的流动相部分。

正相色谱*

一种洗脱方法，其中固定相比流动相极性更强。该术语用于液相色谱，以强调与反相色谱的对比。

峰* [请参阅“理论塔板数”]

单个组分从色谱柱中洗脱时，记录检测器响应的差示色谱图部分。如果分离不完全，两种或多种组分可能会洗脱成为一个未分离的峰。在理想条件下，在尽可能减少谱带展宽的系统中运行填充良好的高效色谱柱，从中洗脱出的峰接近高斯分布的形状。通常通过测量峰面积[被基线和峰曲线包围]以进行定量。在较少的情况下，也可以使用峰高[从峰顶到基线的测量距离]进行定量。这种方法要求峰宽和峰形均保持恒定。

理论塔板数* [N，请参阅“柱效”]

指示色谱柱性能的数字[机械分离能力或柱效，又称塔板数]。理论塔板数可将峰保留的大小与峰宽相关联[方差或谱带展宽]。为计算理论塔板数，需假定峰可以用高斯分布[统计学钟形曲线]来表示。在拐点[峰高的60.7%]处，高斯曲线的宽度是其平均值[位于峰顶]标准偏差[σ]的两倍。如图U所示，在峰高的其他部分测得的高斯曲线的峰宽可以用精确定义的σ倍数来表示。峰保留[保留体积，V_R，或保留时间，t_R]和峰宽必须用相同的单位表示，因为N是无量纲数。请注意，用于计算N的5σ法对于色谱柱均匀性和性能要求更严格，因为峰不对称对该方法的影响更严重。计算机数据工作站可自动绘制每个分离的峰并计算其对应的理论塔板数。

制备型色谱

利用液相色谱分离出一定量达到足够纯度的化合物用于后续实验或其他用途的色谱方法。在制药或生物技术纯化过程中，可使用直径数英尺的色谱柱分离数千克的材料。对于几微克的珍贵天然产物分离，分析型HPLC色谱柱足以满足要求。两种色谱柱都使用制备型色谱方法，仅在规模上有所不同[请参阅有关“HPLC规模”的小节和表A]。

分离度* [Rs，请参阅“选择性”]

两个峰互相分离的程度，表示为二者的保留时间之差除以它们在基线处的平均峰宽。R_s = 1.25表明峰宽相同的两个峰刚好在基线处分离。R_s = 0.6时，色谱图中存在两个峰的唯一迹象是峰顶点附近有一个小凹口。柱效更高的色谱柱可产生更窄的峰并改善复杂分离的分离度；但是，分离度仅随N平方根的增加而增加。要提高分离度，一种十分有效的方法是通过改变色谱分离所用的流动相/固定相组合来提高选择性[请参阅有关“化学分离能力”的小节]。

保留因子* [k]

样品组分在固定相中的滞留时间相较于它在流动相中滞留时间的量度；它表示样品组分滞留在固定相中与样品组分以流动相速度通过色谱柱相比，所需时间长多少。在数学上，保留因子是调整保留时间[体积]与死时间[体积]的比率：k = t_R'/t_M [请参阅“保留时间”和“选择性”]。

注：过去，该术语也表示为分配比、容量比、容量因子或质量分配比，并用k'表示。

保留时间* [tR]

从洗脱开始[在HPLC中通常为进样或样品引入的时间点]到峰最大值出现的时间。调整保留时间t_R'的计算方法是从t_R中减去死时间[t_M，完全不保留的分析物从进样到其峰最大值出现的洗脱时间]。

反相色谱*

液相色谱中使用的一种洗脱方法，其中流动相的极性明显高于固定相，例如，微孔二氧化硅材料，其烷基链键合至其可接触的表面。注：请避免误用术语reverse phase。[有关反相分离机制的一些新想法，请参阅参考资料4。]

选择性[分离因子，σ]

用于描述在特定流动相和固定相组成的分离体系中，一对分析物之间相对热力学亲和性差异大小的术语。适合的术语为分离因子[σ]。分离因子等于保留因子之比，k2/k1 [请参阅“保留因子”]；根据定义，σ始终≥ 1。如果σ = 1，则两个峰共洗脱，没有获得分离。在制备型色谱中，尽可能增大σ对于获得理想的载样量和通量至关重要。[请参阅有关“化学分离能力”的小节]

灵敏度* [S]

进入检测器的流动相中某种物质的单位浓度或单位质量数的信号输出，例如线性校正曲线的斜率[请参阅“检测器”]。对于浓度敏感型检测器[例如，UV/Vis吸光度检测器]，灵敏度是峰高与峰中分析物浓度的比率。对于质量数流量敏感型检测器，灵敏度是峰高与单位质量数的比率。如果灵敏度是唯一的性能特征，则它必须只取决于化学测定过程，而不是缩放因子。

检测[检定]或测量[定量]分析物的能力受许多仪器方面和化学因素的影响。理想情况是，从高效色谱柱[窄峰宽，最大峰高处具有良好的对称性]中洗脱出分离度良好的峰[最大选择性]，以及检测器灵敏度和特异性良好。还应当尽可能减小分离系统的干扰和电子组件的噪音，以获得理想的灵敏度。

固相萃取[SPE]

一种样品制备技术，通过LC原理从微型色谱柱床中的复杂基质中分离、浓缩和/或纯化分析物。离线SPE [手动或自动]在单个塑料小柱或μElution板孔中使用较大颗粒完成，使用低正压或真空以辅助液体流动。在线SPE在微型HPLC色谱柱中使用较小颗粒完成，通过较高的压力以及使用阀在SPE柱与主HPLC色谱柱之间在线切换或离线切换至废液（根据需要）。

SPE方法使用分级梯度[请参阅“梯度”]完成柱床钝化、上样、清洗和洗脱步骤。通常在重要分析物的k值尽可能高的条件下上样，使这些分析物在上样和清洗步骤中能够完全保留。然后通过转换为更强的溶剂混合物完成洗脱[请参阅“洗脱强度”]。固相萃取的目标是去除基质干扰物质并分离溶液中的分析物，使分析物达到适合后续分析的浓度。

速度[请参阅“柱效”、“流速”、“分离度”]

使用体积较小、颗粒较小的分析柱或体积较大、颗粒较大的制备柱以较高的线速度进行LC分离的优势。LC速度在1972年[使用10 μm颗粒和在6000 psi下可提供准确流动相流量的泵]、1976年[使用75 μm制备色谱柱，在500 mL/min的流速下运行]，和2004年[推出UPLC技术 - 1.7 μm颗粒色谱柱，在15,000 psi下运行]取得了量级上的进步†。

高速分析型LC系统不仅仅需要适应整个流路的更高压力；进样器循环时间必须较短；梯度混合器必须能够在样品之间快速周转；检测器传感器必须对洗出液组分的细微变化作出快速响应；并且数据系统必须每秒采集数个点，以便准确地绘制和定量窄峰。

总之，分离度越高、速度越快、柱效越高，则通量通常越高。在一个工作日内可以分析更多样品。每次运行或每个处理周期可以纯化更多化合物。

固定相*

组成色谱系统的两相之一。固定相可以是固体、凝胶或液体。如果为液体，则可能是分布在固体上。这种固体可能有助于分离过程，也可能对分离过程没有帮助。液体也可以与固体进行化学键合[键合相]或固定在其上[固定化固定相]。

色谱柱床或吸附剂的表述可用作通用术语，表示其中使用固定相的任何不同形式。

不建议使用术语液相来表示LC中的流动相。这样可以避免与气相色谱混淆，气相色谱中的固定相称为液相[通常是涂覆在固体支撑物上的液体]。

开放式色谱柱中的液液分配色谱[LLC]不能很好地转换为HPLC。它被键合相填充物的应用所取代。LLC经证实与现代检测器不兼容，因为固定相液体涂层可能会从固态载体上渗出，从而污染与其不相容的液体流动相。

UPLC技术

为适应亚2 μm颗粒和极高运行压力而整体设计的高效液相色谱系统称为超高效液相色谱[UPLC技术]†。与HPLC相比，该技术的主要优势在于，可显著提高分离度，和/或运行速度更快，同时可保持现有HPLC分离中的分离度。

†有关详细信息，请访问：https://www.waters.com/uplc