液相色谱初学者指南

色谱柱管和接头必须包含用于实现分离的色谱填料[固定相]。其必须能够耐受制造和使用过程中产生的柱压。此外，它必须为入口处的样品和出口处的分析物谱带提供受到严格控制的[无泄漏、小体积和零死体积]流路，并且相对于分离体系[样品、流动相和固定相]具有化学惰性。大多数色谱柱由不锈钢制成，具有出色的耐压能力。PEEK[一种工程塑料]和玻璃虽然耐压能力较低，但可以用于需要惰性表面的特殊化学或生物应用中。[图M-1]。

玻璃柱壁具有直观可视的优势。如图M-2所示，当样品谱带仍在色谱柱中时，流动已停止。可以看到，进样的样品混合物中的三种染料已经在柱床中分离；其中黄色分析物行进速度最快，即将流出色谱柱。

分离性能 - 分离度

两种化合物分离的程度称为色谱分离度[RS]。决定HPLC色谱柱能够实现的总体分离能力或分离度的两个主要因素是：由柱长、粒径和填充床均匀性所产生的机械分离能力，以及由填料与流动相之间对化合物的理化竞争所产生的化学分离能力。柱效是机械分离能力的量度，而选择性则是化学分离能力的量度。

机械分离能力 – 柱效

如果柱床稳定且填充均匀，其机械分离能力将取决于柱长和粒径。机械分离能力又称“柱效”，通常以塔板数[符号 = N]来衡量和比较。填充较小颗粒的色谱柱柱床具有更高的柱效和柱压。对于给定的粒径，增加柱长可以获得更高的机械分离能力。然而，代价是色谱运行时间更长、溶剂消耗量更多和柱压更高。使用较短的柱长可以起到尽量控制以上变量的效果，但也会降低机械分离能力，如图N所示。

对于给定的颗粒填料、流动相和流速，如图O所示，柱长和内径相同但粒径更小的色谱柱将在相同的运行时间内提供更高的机械分离能力。但是，其柱压将高很多。

化学分离能力 – 选择性

颗粒填料[固定相]与流动相组成的组合（即分离体系）的选择将决定化学分离能力的程度[改变各种分析物的速度的能力]。优化选择性是实现分离的最有力的手段；这可以避免尽可能提高机械效率所需的强力。为分离任何两种指定的化合物，科学家可以在多种相组合[固定相和流动相]与保留机制[色谱模式]中进行选择。这些内容将在下一章节予以讨论。