液相色谱初学者指南

基本的高效液相色谱[HPLC]系统的组件如图E中的简图所示。

溶剂瓶盛放溶剂[称为流动相，因为它会移动]。高压泵[溶剂输送系统或溶剂管理器]用于生成和计量具有特定流速的流动相，通常为数毫升/分钟。进样器[样品管理器或自动进样器]能够将样品引入[注入]连续流动的流动相液流中，该流动相液流将样品带入HPLC色谱柱中。色谱柱包含实现分离所需的色谱填料。该填料被称为固定相，因为它由色谱柱硬件固定在适当位置。需要检测器来查看从HPLC色谱柱中洗脱出来的分离化合物谱带[大多数化合物无颜色，因此无法通过肉眼查看]。流动相离开检测器，可根据需要送至废液或收集起来。当流动相包含分离的化合物谱带时，HPLC能够收集包含该纯化化合物的洗脱液馏分以供进一步研究。这称为“制备型色谱”[在“HPLC规模”一节中予以讨论]。

请注意，高压管路和接头用于互连泵、进样器、色谱柱和检测器组件，以形成用于流动相、样品与所分离的化合物谱带的管道。

检测器连接到计算机数据工作站（一种HPLC系统组件，可记录在显示器上生成色谱图以及鉴定和定量样品成分浓度所需的电信号）（见图F）。现已开发出几种不同类型的检测器以应对特性差异极大的不同样品化合物。例如，如果化合物可以吸收紫外线，则使用UV吸光度检测器。如果化合物发出荧光，则使用荧光检测器。如果化合物不具备这些特性中的任一者，则使用更通用的检测器类型，例如蒸发光散射检测器[ELSD]。一种十分有效的方法是串联使用多个检测器。例如，UV和/或ELSD检测器可与质谱仪[MS]结合使用，以分析色谱分离的结果。这样即可通过单次进样获得更全面的分析物信息。将质谱仪与HPLC系统联用的做法称为LC-MS。

HPLC操作

图G是有关样品中所包含化合物的分离机制的简单示意图。

流动相从左侧进入色谱柱，通过颗粒床，并从右侧流出。流向用绿色箭头表示。首先来看上图，该图表示时间零处[进样时刻]的色谱柱，此时样品进入色谱柱并开始形成谱带。此处显示的样品为黄色、红色与蓝色染料的混合物，在色谱柱入口处显示出一个黑色谱带。[实际上，该样品可以是任何可溶解于溶剂中的物质；通常化合物是无色的并且柱壁不透明，因此需要检测器来查看洗脱时分离的化合物。]

几分钟后[下图]，在此期间流动相连续稳定地流过填料颗粒，可以看到各种染料以不同的速度在单独的谱带中移动。这是由于流动相和固定相之间竞争吸引各种染料或分析物。请注意，黄色染料带移动最快，即将流出色谱柱。黄色染料比其他染料更亲近[容易被吸引至]流动相。因此，它以更快的速度（更接近流动相的速度）移动。蓝色染料谱带更亲近填料而非流动相。它更强地被吸引至颗粒，导致其移动速度明显较慢。换言之，它是该样品混合物中保留时间最长的化合物。红色染料谱带对流动相具有中等吸引力，因此以中等速度通过色谱柱。由于每个染料谱带以不同的速度移动，因此可以通过色谱法将其分离。

什么是检测器？

随着分离的染料谱带离开色谱柱，它们立即进入检测器。检测器包含流通池，该流通池可在流动相的背景下查看[检测]每种分离的化合物谱带[见图H]。[实际上，许多化合物在典型的HPLC分析浓度下的溶液是无色的。]合适的检测器能够感测化合物的存在并将其相应的电信号发送至计算机数据工作站。如前所述，可以根据需要分离和分析的化合物的特性和浓度选择适当的检测器类型。

什么是色谱图？

色谱图反映了在HPLC系统中发生的化学[色谱]分离。横轴是时间轴，上面绘制了从基线上升的一系列峰。每个峰代表不同化合物的检测器响应。色谱图由计算机数据工作站绘制[见图H]。

在图H中，黄色谱带已完全通过检测器流通池；产生的电信号已发送至计算机数据工作站。所得色谱图已开始显示在屏幕上。请注意，色谱图从第一次进样时开始，开始时是靠近屏幕底部的一条直线。这条线称为基线；它代表随时间推移而通过流通池的纯流动相。当黄色分析物谱带通过流通池时，会向计算机发送更强的信号。曲线先向上，然后向下，与样品谱带中黄色染料的浓度成正比。这样就在色谱图中形成了一个峰。黄色谱带完全通过检测器流通池后，信号水平恢复基线；现在，流通池中再次只有纯流动相。由于黄色谱带移动速度最快，先从色谱柱上洗脱下来，因此它是第一个绘制的峰。

片刻之后，红色谱带到达流通池。随着红色谱带首次进入流通池，信号从基线上升，并且开始绘制代表该红色谱带的峰。在此图中，红色谱带尚未完全通过流通池。图中显示了此时停止该过程时红色谱带和红色峰的状态。色谱图因为大部分红色谱带已通过流通池因此已绘制大部分峰，如实线所示。如果我们可以重启，红色谱带将完全通过流通池，红色峰将会完成[虚线]。蓝色谱带保留性最强，移动速度最慢，在红色谱带之后洗脱。虚线显示了继续运行至结束后所得到的完整色谱图。值得注意的是，蓝色峰的宽度将是最宽的，因为蓝色分析物谱带的宽度虽然在色谱柱上最窄，但在从色谱柱上洗脱时变得最宽。这是因为它在色谱填料床中的移动速度较慢，需要更多时间[和更多的流动相体积]才能完全洗脱。由于流动相以固定速率连续流动，这意味着蓝色谱带变宽并且更稀。由于检测器的响应与谱带的浓度成正比，因此蓝色峰的高度较低，但宽度较大。