Der Leitfaden zur Massenspektrometrie

Elektronen-Ionisierung (EI)

Viele sind mit der Elektronen-Ionisierung (EI) vertraut. (Manchmal wird auch der frühere Begriff „Elektronenstoß“ verwendet, der jedoch technisch gesehen nicht korrekt ist). Die EI, bei der eine Probe häufig mit 70 eV-Elektronen bestrahlt wird, wird als „hartes“ Verfahren bezeichnet. Die Energie der Elektronen, die mit dem betreffenden Molekül in Wechselwirkung treten, ist in der Regel viel größer als die in den Bindungen enthaltene Energie, sodass es zur Ionisierung kommt. Die überschüssige Energie bricht die Bindungen auf eine gut charakterisierte Weise. Das Ergebnis sind vorhersehbare, identifizierbare Fragmente, aus denen wir auf die Identität des Moleküls schließen können. Wenn man nur ein Elektron aus der äußeren Schale abzieht, erhält man ein positiv geladenes Radikalkation (M.+) und ein reiches Spektrum an Fragmenten. Im Gegensatz zu „sanfteren“ atmosphärischen Ionisierungsverfahren, die eine spektrale Reaktion erzeugen, die manchmal für das spezielle Quellendesign des Herstellers charakteristisch ist, ist die EI-Technik ziemlich unabhängig vom Quellendesign. Ein Spektrum, das von einem EI-Gerät erzeugt wird, sieht einem Spektrum derselben Verbindung von einem anderen EI-Gerät sehr ähnlich; eine Tatsache, die sich für die Erstellung von Spektralbibliotheken anbietet, um unbekannte Verbindungen mit Referenzspektren abzugleichen.

Chemische Ionisation (CI)

Moleküle, die übermäßig fragmentieren, erfordern „sanfte“ Techniken. Die chemische Ionisation (CI) erzeugt Ionen durch einen sanfteren Protonentransferprozess, der das Erscheinungsbild des Molekülions selbst bewahrt und fördert. Die Probe wird einem Überschuss an Reagenzgas ausgesetzt, wie es entsteht, wenn Methan das protonierte Molekülion (M+H) bildet. Der umgekehrte Prozess kann negative Ionen erzeugen. Durch die Übertragung des Protons auf das Gasmolekül kann in einigen Fällen das negative Ion entstehen (M-H).

Die chemische Ionisation (CI) wird manchmal für Verbindungen verwendet, deren chemische Zusammensetzung derjenigen ähnelt, die mit EI analysiert werden, um die Häufigkeit oder das Aussehen des Molekülions zugunsten einer signifikanten Fragmentierung zu erhöhen. Ähnlich wie bei der EI müssen die Proben thermisch stabil sein, da die Erwärmung in der Quelle zur Verdampfung führt. Der Ionisierungsmechanismus von CI beruht auf EI für den ersten Ionisierungsschritt, aber in der Quelle befindet sich ein chemisches Reagenzgas, wie Methan, Isobutan oder Ammoniak, unter hohem Druck. Das Reagenzgas, das in einer viel höheren Konzentration als der Analyt (R) vorhanden ist, wird durch Elektronenionisierung ionisiert, wobei primäres R+ Reagenzionen entstehen. Die Kollision von R+Ionen mit neutralen R-Molekülen führt zur Bildung stabiler Sekundärionen, die die reaktive Spezies sind, welche dann die Analytmoleküle (A) durch Ionen-Molekül-Reaktionen ionisieren.

So entsteht beispielsweise bei der Ionen-Molekül-Reaktion zwischen einem Methanion und einem Methanmolekül die recht stabile Spezies CH₅⁺.

CH₄^+. + CH₄ --> CH₅⁺ + CH₃^.

Das reaktive Ion CH₅⁺ kann neutrale Analytmoleküle (A) durch Protonentransfer, Hydridabstraktion oder Ladungsaustausch ionisieren.

RH⁺ + A --> R + AH⁺ (Protonenübertragung)

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺ (Hydridabstraktion)

R+^. + A --> R + A^+. (Ladungsaustausch)

Die gängigsten Ionisierungsreaktionen sind die Protonierung, die für Moleküle mit Protonenaffinitäten, die höher als die des Reagenz sind, bevorzugt wird. Bei Molekülen mit geringer Protonenaffinität kommt es häufig zur Abstraktion von Hydriden und bei Reagenzien mit hoher Ionisierungsenergie zum Ladungsaustausch.

Die zu analysierende Substanz steht unter einem viel niedrigeren Druck als das Reagenzgas. Betrachtet man Methan als Reagenzgas, so bewirkt der Elektronenstoß hauptsächlich die Ionisierung des Methans. Dieses fragmentiert zum Teil auf CH₃⁺ Diese Spezies gehen dann unter den hohen Quelldrücken Ionenmolekülreaktionen ein.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

CH₅⁺ kann als Bronsted-Säure und C₂H₅⁺ als Lewis-Säure wirken, um Ionen aus dem Analyten zu erzeugen.

Eine sorgfältige Auswahl des CI-Reagenzgases kann die Ladungsübertragung auf ein Analytmolekül verbessern, da der Säuregrad der Gasphase des chemischen Ionisierungsgases die Effizienz der Ladungsübertragung beeinflusst. Bei der CI ist es wahrscheinlicher, dass der Analyt zu einem Molekülion führt, wobei durch die geringere Fragmentierung die Energie erhalten bleibt, die normalerweise bei der EI zum Aufbrechen von Bindungen internalisiert wird.

Chemische Ionisation mit Negativ-Ionen (NCI)

Eine Variante, die negative chemische Ionisation (NCI), kann mit einem Analyten durchgeführt werden, der elektronenaufnehmende Anteile enthält (z. B. Fluoratome oder Nitrobenzylgruppen). Die Empfindlichkeit kann um ein Vielfaches höher sein (Reports zufolge in einigen Fällen um das 100- bis 1000-fache) als bei der EI. Die NCI ist auf eine Vielzahl kleiner Moleküle anwendbar, die chemisch modifiziert sind (oder werden können), um den Elektroneneinfang zu fördern.

Bei negativen Ionen gibt es zwei Hauptmechanismen, durch die negative Ionen erzeugt werden: Elektroneneinfang und chemische Ionisation des Reaktanten. Unter Bedingungen der CI können elektronegative Moleküle thermische Elektronen einfangen, um negative Ionen zu erzeugen. Die chemische Ionisation mit echten negativen Ionen erfolgt durch Reaktion einer Analytverbindung (AH) mit negativ geladenen Reaktantenionen (R^-. oder R^-). Es gibt verschiedene Arten von Ionen-Molekül-Reaktionen, von denen die häufigste die Protonenabstraktion ist.

AH + R^-  -> A^- + RH

Je höher die Protonenaffinität (Basizität) des reaktiven Ions ist, desto wahrscheinlicher ist eine Protonenabstraktion.

Gaschromatographie (GC)

Die erste Begegnung mit einem Massenspektrometer machen viele womöglich mit dem Detektor für einen Gaschromatographen. Die Palette der GC-MS-Gerätetypen wurde erweitert, um die Einschränkungen früherer Gerätedesigns zu überwinden oder um immer strengere gesetzliche Vorschriften in Applikationen wie Umweltanalysen, Screeninguntersuchungen in der Lebensmittelsicherheit, Metabolomik und klinischen Applikationen wie Forensik, Toxikologie und Wirkstoffscreening zu erfüllen.

In der Vergangenheit dominierten zwei Arten von Massenspektrometern die GC-MS-Analyse: Magnetsektor- und Einzel-Quadrupol-Geräte. Erstere, die eine hohe Auflösung und genaue Massenanalysen ermöglichten, wurde bei Applikationen eingesetzt, die extreme Empfindlichkeit erforderten. Letztere führte Routineanalysen von Zielverbindungen durch.

Die anspruchsvollsten GC-MS-Analysen waren den Geräten des Magnetsektors vorbehalten: Dioxine in Umwelt-/Industrieproben oder Screening auf den illegalen Einsatz von leistungssteigernden Medikamenten im Leistungssport. Femtogramm-Nachweisgrenzen bei hoher Auflösung/Selektivität werden mit Magnetsektorgeräten problemlos erreicht.

Schon kurz nach ihrer Einführung setzten sich Quadrupol-GC-MS-Systeme in der Zielanalytik durch. Die USEPA-Methoden schreiben den Einsatz von Quadrupol-GC-MS-Geräten für die Analyse von Proben auf zahlreiche Umweltschadstoffe vor. Da für diese Applikationen nur Nachweise im Pikogramm- bis Nanogrammbereich erforderlich sind, stellt die geringere Empfindlichkeit des Quad im Vergleich zum Sektor keine Einschränkung dar. Im Gegenteil, die stark reduzierten Kosten, die Benutzerfreundlichkeit und die Tragbarkeit erwiesen sich als ein echter Glücksfall.

Flüssigchromatographie (LC)

Die revolutionäre Technologie, die uns analytischen Zugang zu etwa 80 % des chemischen Universums verschafft hat, die mit GC nicht erreichbar sind, ist auch für das phänomenale Wachstum und Interesse an der Massenspektrometrie in den letzten Jahrzehnten verantwortlich. Einige wenige Personen werden herausgegriffen (siehe den Abschnitt „Eine kurze Geschichte“), die LC mit MS kombiniert haben. Die LCMS, wie wir sie heute kennen, begann vermutlich in den 1970er-Jahren und wurde Anfang der 1990er-Jahre ausgereift. Viele der Geräte und Techniken, die wir heute in der Praxis verwenden, stammen direkt aus dieser Zeit.

Die Flüssigkeitschromatographie wurde Anfang des 20. Jahrhunderts durch die Arbeit des russischen Botanikers Mikhail S. Tswett definiert. Seine Studien konzentrierten sich auf die Trennung von Blattfarbstoffen, die aus Pflanzen mithilfe eines Lösungsmittels in einer mit Partikeln gefüllten Säule extrahiert wurden. In ihrer einfachsten Form beruht die Flüssigchromatographie auf der Fähigkeit, konkurrierende Wechselwirkungen zwischen Analyten in Lösung (der mobilen oder kondensierten Phase), die über ein Bett aus gepackten Partikeln (die stationäre Phase) geleitet werden, mit großer Präzision vorherzusagen und zu reproduzieren. Die Entwicklung von Säulen, die in den letzten Jahren mit einer Vielzahl von funktionellen Bestandteilen gepackt wurden, und von Lösungsmittelzufuhrsystemen, die die mobile Phase präzise zuführen können, hat die LC zum analytischen Rückgrat für viele Industriezweige werden lassen.

Die Abkürzung HPLC wurde 1970 von Csaba Horváth geprägt, um darauf hinzuweisen, dass der für die Flüssigkeitschromatografie in gepackten Säulen erforderliche Fluss mit hohem Druck erzeugt wird. Durch die kontinuierlichen Fortschritte bei der Leistung, einschließlich der Entwicklung kleinerer Partikel und größerer Selektivität, hat sich die Bedeutung des Akronyms in Hochleistungsflüssigkeitschromatographie geändert.

Im Jahr 2004 wurde durch weitere Fortschritte bei der Geräte- und Säulentechnologie eine signifikante Verbesserung der Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit in der Flüssigkeitschromatographie erreicht. Säulen mit kleineren Partikeln [1,7 Mikron] und Geräte mit speziellen Fähigkeiten, die die mobile Phase mit einem Druck von 1000 bar [15000 psi] fördern können, wurden als UPLC-Technologie bekannt, die den differenzierten Begriff der Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie darstellt. Vieles von dem, was die heutige Technologie ausmacht, wurde von Forschern wie John Knox in den 1970er-Jahren vorhergesagt. Knox sagte voraus, dass der optimale Partikeldurchmesser bei 1 – 2 m liegt und die Chromatographie thermisch empfindlich auf Reibungswärme reagiert. Auf dem Weg zur Entwicklung der UPLC für den breiten Einsatz musste zwangsläufig eine Technologie gefunden werden, die in der Lage ist, robuste, einheitliche kleine Partikel zu entwickeln.Sehen Sie sich hier einen gute Leitfaden zur HPLC und UPLC an.

Elektrospray (ESI)

Der allgemeine Begriff „Atmosphärendruck-Ionisierung“ (API) umfasst die bekannteste Technik, Elektrospray-Ionisierung (ESI), die ihrerseits die Grundlage für verschiedene, verwandte Techniken bildet, die Ionen bei Atmosphärendruck und nicht im Vakuum erzeugen können. Die Probe wird in einem polaren Lösungsmittel (in der Regel weniger flüchtig als das bei der GC verwendete) gelöst und durch eine Edelstahlkapillare gepumpt, die zwischen 2000 und 4000 V führt. Die Flüssigkeit aerosoliert beim Verlassen der Kapillare bei Atmosphärendruck, wobei die sich auflösenden Tröpfchen Ionen abwerfen, die durch die kombinierte Wirkung von elektrostatischer Anziehung und Vakuum in das Massenspektrometer fließen.

Der Mechanismus, durch den das Potential von der Flüssigkeit auf den Analyten übertragen wird, wobei Ionen entstehen, wird nach wie vor kontrovers diskutiert. 1968 schlug Malcolm Dole erstmals den Ladungsrückstandsmechanismus vor, der besagt, dass die Ladung eines Tropfens beim Verdunsten unverändert bleibt. Die Oberflächenspannung des Tröpfchens kann den abstoßenden Kräften der auferlegten Ladung nichts entgegensetzen und zerfällt in viele kleinere Tröpfchen. Diese Coulomb-Spaltungen erfolgen so lange, bis nur noch Tröpfchen mit einem einzigen Analyt-Ion übrig bleiben. Wenn das Lösungsmittel aus dem letzten Tröpfchen verdampft, bildet sich ein Gasphasenion.

1976 schlugen Iribarne und Thomson ein anderes Modell vor, den Ionenverdampfungsmechanismus,, bei dem sich kleine Tröpfchen durch Coulomb-Spaltung bilden, ähnlich wie im Modell von Dole. Nach der Theorie der Ionenverdampfung ist die elektrische Feldstärke an der Tröpfchenoberfläche jedoch so hoch, dass es für solvatisierte Ionen energetisch günstig ist, die Tröpfchenoberfläche zu verlassen und direkt in die Gasphase überzugehen.

Es ist möglich, dass die beiden Mechanismen zusammenwirken: Der Mechanismus der Ladungsrückstände dominiert bei Massen über 3000 Da, während die Ionenverdampfung bei niedrigeren Massen dominiert (siehe R Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, S. 763 – 772 (2000).

Die Flüssigkeit aus dem Flüssigkeitschromatographen gelangt im Zustand des Ladungsausgleichs in den ESI-Sprühkopf. Wenn das Lösungsmittel den ESI-Sprühkopf verlässt, trägt es also eine Ionen-Nettoladung. Damit ESI ein kontinuierliches Verfahren ist, muss die Lösung durch elektrochemische Reaktionen aufgeladen werden, wobei Elektronen auf eine leitende Oberfläche übertragen werden, die als Elektrode dient. Dieser Vorgang kann unter anderem zu Veränderungen des pH-Werts führen. Es wird davon ausgegangen, dass im positiven Modus positiv geladene Tröpfchen das Spray verlassen und Elektronen von der Elektrode aufgenommen werden (Oxidation). (Im negativen Modus wäre es umgekehrt.) Die Oberfläche der elektroaktiven Elektrode, die Höhe des Stroms und die Art der chemischen Spezies und deren Elektrodenpotentiale haben alle einen Einfluss.

Alles in allem ist die ESI ein effizientes Verfahren. Allerdings sind die Aktivierungsenergie und die Energiedifferenz für die Reaktion insgesamt für die einzelnen Arten unterschiedlich. Die Flussrate der Lösung und der angelegte Strom bestimmen die Grenzen für jedes Tröpfchen. Es kommt zu einer Konkurrenz zwischen Molekülen und die Unterdrückung von interessierenden Analyten ist nicht ungewöhnlich.

Erweiterungen der grundlegenden ESI-Theorie, wie z. B. die Reduzierung des Flüssigkeitsvolumens auf extrem niedrige Werte – z. B. auf 30 nL/min im Fall von NanoSpray – haben sich als wirksam erwiesen, insbesondere bei probenbegrenzten Untersuchungen von Proteinen und Aminosäuren.

Chemische Ionisation unter Atmosphärendruck (APCI)

Obwohl die Arbeiten zur Demonstration der APCI parallel zu denen zur Demonstration von ESI veröffentlicht wurden, fand die APCI erst mit der Kommerzialisierung von ESI breite Anwendung, die vor dem Hintergrund von Fenns Arbeit im Jahr 1985 erfolgte.

Horning führte die APCI erstmals 1973 ein, um flüchtige Verbindungen mithilfe verschiedener Einführungstechniken zu analysieren, darunter die HPLC. Die zusätzliche Fähigkeit der APCI ermöglicht es Analyten, die sich der Umwandlung in Gasphasen-Ionen durch die ESI widersetzen, die weniger polaren und flüchtigeren Ionen aus einer kondensierten Phase oder einem Flüssigkeitsstrom in ein Massenspektrometer einzuführen. Im Gegensatz zur ESI werden bei der APCI neutrale Analyten in die Gasphase überführt, indem die eingeführte Flüssigkeit in einem erhitzten Gasstrom verdampft wird. Die chemische Ionisation beruht auf dem Transfer geladener Spezies zwischen einem Reagenzion und einem Zielmolekül, um ein Zielion zu erzeugen, das massenanalysiert werden kann. Am häufigsten bildet sich im positiven Ionenmodus ein Addukt zwischen dem Zielmolekül und dem kleinen H⁺ Ion, obwohl auch Addukte mit Salzen üblich sind. Beispielsweise kann sich das Ammoniumaddukt (M+NH₄)⁺ bilden, wenn das schwach saure, schwach basische Salz Ammoniumacetat in der mobilen Phase vorhanden ist, ein Modifizierungsmittel, das häufig anstelle des weniger flüchtigen und stark ionischen Phosphatpuffers verwendet wird. Bei höheren Salzkonzentrationen kann die Konkurrenz zwischen der protonierten und der ammonierten Form zu einer verminderten Reaktion bei beiden führen. Die maximale Anzahl der Ionen, die durch die APCI gebildet werden können, ist viel größer als bei der ESI, da sich die Reagenzionen redundant bilden. Die Flüssigkeit wird durch ein nichtleitendes Röhrchen, meist aus Quarzglas, gedrückt, das von einem Vernebelungsgas umströmt wird. Die dabei entstehenden feinen Tröpfchen prallen auf die innere, beheizte Wand eines Röhrchens oder eines Sprühkopfs, das bzw. der über das Ende des nichtleitenden Röhrchens hinausragt, und werden so in die Gasphase überführt. Diese Art der Ionisierung wird oft mit viel höheren linearen Geschwindigkeiten durchgeführt als die Flussraten der HPLC oder der Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC), die normalerweise mit Elektrospray verbunden sind. Moderne Geräte bieten jedoch eine viel größere Desolvationskapazität, die die Leistung aller aerosolabhängigen Techniken verbessert.

Die desolvatisierten Analytmoleküle werden dann durch chemische Ionisation ionisiert. Das ionisierende Potential wird nicht wie bei der ESI durch die Flüssigkeit, sondern an der Spitze einer Nadel als Plasma oder Korona angelegt, durch die die Tröpfchen hindurchgehen. Die mobile Phase fungiert dabei als Vermittler, der die Ladung auf den Analyten überträgt. Daher auch die frühe Bezeichnung APCI als „lösungsmittelvermitteltes Elektrospray“.