Leitfaden zur Massenspektrometrie

Wenn eine Verbindung bereits bekannt ist, wie es bei klinischen Studien der Fall ist, bei denen statistische Daten von vielen individuellen Proben gesammelt werden und das verabreichte Arzneimittel sowie der interessierende Metabolit bereits gut charakterisiert sind, sind keine vollständigen Massenspektren erforderlich. Allerdings ist eine sehr gute Empfindlichkeit in einem komplexen physiologischen Gemisch erforderlich. Daher ist das Gerät so eingestellt, dass es nur spezifische m/z-Werte überwacht. (Siehe Vergleich der SIR- und MRM-Signale weiter oben in diesem Leitfaden).

Da durch das Triple- oder Tandem-Quadrupol kontinuierlich Ionen strömen, muss der Ionenstrom in den Massenanalysator nicht begrenzt werden. Die Ionenfalle hingegen hat ein definiertes, endliches Volumen und benötigt daher eine Funktion, die verhindert, dass zu viele Ionen in die Falle gelangen. Wird die Ionenintensität nicht gesteuert, treten unerwünschte oder unerwartete Peaks im Spektrum auf. Dies ist ein besonders störendes Phänomen bei der Suche nach EI-Spektren in GC-MS-Bibliotheken. Das Design von Ionenfallen hat sich wesentlich geändert, um eine externe (Ionen, die außerhalb des Massenfilters mit anschließender Ioneninjektion in die Falle erzeugt werden) anstelle einer internen Ionisierung (Ionisierung innerhalb des Massenfilters) zu ermöglichen. Durch die Änderung des Designs wurde das Problem der Ionenmolekülreaktionen in der Falle angegangen, es kam jedoch auch zu einer neuen Einschränkung. Selbst im MRM-Modus kann diese automatische Regulierung des Gesamtionenstroms zu unregelmäßigen Probenahmeintervallen über einen chromatographischen Peak führen. Letztendlich ist die Ionenfalle daher als Werkzeug für die Spurenanalyse in komplexen Matrizes begrenzt, insbesondere wenn höchste Genauigkeit und Präzision erforderlich ist, wie dies bei Daten der Fall ist, die rechtlich vertretbar sein müssen oder deren strenge Kriterien für Genauigkeit und Präzision der Quantifizierung gesetzlich vorgeschrieben sind.

Bei der MS-Quantifizierung wird in der Regel ein interner Standard verwendet. Der Standard bietet Kontrollen über die Variabilität bei Extraktionsprozessen, LC-Injektion und Ionisierung. Ohne internen Standard können die RSD-Werte bei Wiederholungen um das Zehnfache höher sein als bei Wiederholungen, die auf einen Standard verweisen, der in der Regel RSD-Werte im niedrigen einstelligen Bereich produziert. Der beste interne Standard ist eine isotopenmarkierte Version des interessierenden Moleküls. Auch wenn sich die Synthese eines solchen Moleküls als kostspielig herausstellt, zeigt es im Massenspektrometer eine ähnliche Extraktionswiederfindung, chromatographische Retentionszeit und ein ähnliches Ionisierungssignal.

Die Beurteilung der Systemeignung, die Zufallsauswahl der Proben und die Bestimmung geeigneter Kurven und Konzentrationspunkte sind Gegenstand langwieriger Diskussionen. Einige gute Referenzen finden Sie unter https://www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm

Kalibrierung

Kalibrierverbindungen werden von einem Massenspektrometer verwendet, um die Massenkalibrierungsskala sowie die relativen Intensitäten der Ionen so anzupassen, dass sie mit denen bekannter Einheiten übereinstimmen. Dieser Vorgang wird bei allen Massenspektrometern durchgeführt, da geringfügige Änderungen der Elektronik, der Sauberkeit der Oberflächen und der Umgebungsbedingungen eines Labors die Fähigkeit des Geräts, aussagekräftige Messungen zu reproduzieren, beeinträchtigen können. Bei den am wenigsten anspruchsvollen Analysen mit Geräten mit nominaler Masse kann die Notwendigkeit einer Kalibrierung seltener und eine Überprüfung des Signals häufiger sein. Dennoch erfordert eine hohe Massengenauigkeit eine ständige Überwachung auf kleinste Änderungen.

Eine für die GCMS gängige Kalibrierverbindung ist FC-43, auch Perfluortributylamin genannt. Andere Mischungen von Kalibrierverbindungen werden verwendet, um die Kalibrierskala eines hochauflösenden Massenspektrometers anzupassen. Für die LCMS werden häufig Gemische aus Natriumcaesiumjodid (NaCsI) und Polyethylenglykol verwendet. In einem LCMS-kompatiblen Lösungsmittel liefert NaCsI, das in ein Gerät geströmt oder infundiert wird, eine Reihe von monoisotopen Peaks über 4000 Da.

Es sind Kits erhältlich, die eine Auswahl an Standardpeptiden, Proteinen, Matrizes und Lösungsmitteln für die Kalibrierung, Abstimmung und Empfindlichkeitsprüfung von Massenspektrometern für die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (matrix-assisted, laser-desorption ionization, MALDI) enthalten. Ein Kit, von Sigma Aldrich, ist ein Hilfsmittel für die Analyse komplexer Gemische von Proteinen und Peptiden (700 bis 66000 Da).

Lockmasse

Für die anspruchsvollsten Messungen mit ToFs und ähnlichen hochpräzisen Geräten ist ständige Wachsamkeit erforderlich. Eine kleine Änderung der Temperatur allein kann die gemeldeten Massenergebnisse um viele Teile pro Million verschieben. Je nach verwendeter Ionisierungsart kann eine konstante Kalibrierungskorrektur durchgeführt werden, indem einfach eine in der Quelle vorhandene Verunreinigung verwendet wird. Sie können auch in regelmäßigen Abständen Proben eines Ionenstroms nehmen, um während einer Analyse die korrekte Kalibrierung wiederherzustellen. Einfaches Hinzufügen einer Lockmassen-Kalibrierlösung zum strömenden LC-Eluenten durch „Abzweigen“ nach der Säule und vor dem Einlass des Massenspektrometers, verursacht häufig unkontrolliertes Verhalten wie Ionenunterdrückung, Masseninterferenz und Lösungsmitteleffekte.

Time-of-Flight Geräte (ToF) (oben in diesem Leitfaden beschrieben) können eine Genauigkeit von wenigen Teilen pro Million erreichen, und FTICR-Geräte (Fourier-Transform-Ionen-Cyclotron-Resonanz) sind zu einer noch höheren Genauigkeit in der Lage, vorausgesetzt, die Anzahl der eingelassenen Ionen wird gut kontrolliert. Eine Neukalibrierung der Lockmasse in Echtzeit durch Korrekturen jeder Massenverschiebung beseitigt den Massenfehler im Vergleich zu dem, der bei der Kalibrierung der Massenskala festgestellt wurde. Ein schwaches Signal ist eine weitere, gelegentlich übersehene Ursache, die durch eine Mittelwertbildung der Massenmessung über den LC-Peak, gewichtet nach Signalintensität, korrigiert werden kann.

Eine duale Elektrospray-Quelle, die für die Aufnahme exakter Massendaten optimiert wurde, eignet sich ideal für Proteomik-Studien oder die Identifizierung geringer Metaboliten. Bei der Methode mit zwei unabhängigen ESI-Sprühköpfen wird der Korrekturspray- (oder Referenz-)strom mithilfe einer oszillierenden Blende, die von einem programmierbaren Schrittmotor angetrieben wird, entnommen. Vom Referenzspray werden in vordefinierten Intervallen Proben genommen, um sicherzustellen, dass das Aufnahmeverhältnis den Flüssigkeitsstrom begünstigt, der den Analyten enthält. Die Position der Probenahmeblende wird in Echtzeit überwacht, sodass die beiden Flüssigkeitseinlässe indexiert werden können. Die Referenz- und Probendaten werden in getrennten Dateien gespeichert. Das Design verhindert eine Kreuzkontamination zwischen den Analyt- und Referenzkanälen.