Leitfaden zur Massenspektrometrie

Die erhöhte, gemessene Massengenauigkeit und -auflösung ist heute ein vorherrschendes Werkzeug für die strukturelle Charakterisierung in verschiedenen Applikationen, die über die frühe Wirkstoffforschung hinausgehen. Die Quadrupol-Time-of-Flight (QToF)-Geräte, die heute von mehreren Herstellern angeboten werden, verdrängen mit ihrer großen Bandbreite an Spezifität und Nutzen andere LCMS-Technologien.

Auch wenn es Geräte höherer Ordnung gibt, liegt die hohe Massengenauigkeit eines QToF-Geräts innerhalb weniger Teile pro Million des wahren, berechneten Monoisotopenwerts, und seine hohe Auflösung – bis zu zehnmal höher als die eines Quadrupol-Geräts – ermöglicht es uns, empirische Formeln entsprechend dem Massendefekt zu bestimmen (wobei die kritische Massenwert von Wasserstoff und anderen vorhandenen Atomen als Unterscheidungsmerkmal dient). Die Speziationsanalyse – z. B. die Erkennung des Unterschieds zwischen einem Aldehyd und einem Sulfid – wird mit einer Erhöhung der Massengenauigkeit oberhalb der Quadrupol-Grenzen auf 30 ppm möglich, wobei sich die beiden Massen um 0,035 Da unterscheiden. Die Unterscheidung zwischen den Stoffwechselprozessen, an denen die Methylierung beteiligt ist, ist jedoch anspruchsvoller. Die Zugabe von CH₂ führt zu einer Erhöhung der gemessenen Masse von +14,0157 Da gegenüber dem Vorläufer (Reaktion für die Droge allein), verglichen mit einer zweistufigen Biotransformation, die eine Hydroxylierung (Zugabe von Sauerstoff) gefolgt von einer Oxidation an einer Doppelbindung (Verlust von H₂) beinhaltet, welche eine Erhöhung von +13,9792 Da bewirkt. Dennoch sehen beide Messungen, wenn sie durch die nominale Auflösung – eine typische Quadrupolreaktion – begrenzt sind, wie +14 Da aus.

Hohe Massengenauigkeit und niedrige Auflösung

Quadrupol-Geräte mit niedriger Auflösung eignen sich gut für Messungen mit extrem hoher Massengenauigkeit, wie sie bei der Analyse von Proteinen verwendet werden. Die Massen von Proteinen werden im Allgemeinen als „Durchschnittswerte“ definiert, wenn die Isotopenpeaks nicht relativ zueinander aufgelöst sind. Die durchschnittliche Masse ist das gewichtete Mittel aller Isotopenspezies in einem Molekül. Die Geräteauflösung, die normalerweise auf Quadrupol-Geräten verwendet wird, verbreitert die aufgelöste Reaktion für ein 10 kDa-Protein um den Faktor x1,27. Dieser Faktor nimmt mit zunehmender Masse deutlich zu (z. B. auf x2,65 bei 100 kDa) Die Verringerung der Peakbreite auf m/z 0,25 (Erhöhung der Auflösung auf 4000) anstelle der Begrenzung der Geräteauflösung auf 1000 unter Verwendung der typischen Peakbreite (m/z 0,6) führt jedoch zu einer erheblichen Verbesserung.

In der Praxis entstehen bei der ESI-MS-Analyse großer Moleküle mehrfach geladene Ionen. Daher müssen die Breiten durch die Anzahl der Ladungen eines Ions geteilt werden, um die Breite auf der Skala des Masse-Ladungs-Verhältnisses zu erhalten. Ein 20 kDa-Protein mit 10 bzw. 20 Ladungen erzeugt beispielsweise Isotopenhüllen mit einer Breite von 0,9 bzw. 0,45 m/z-Einheiten bei m/z ~2000 bzw. ~1000.

Wenn diese Ionen mit einem Gerät beobachtet werden, das auf eine wesentlich geringere Auflösung eingestellt ist als die, die zur Auflösung der Isotope erforderlich ist (z. B. weniger als 10000), wird für jeden Ladungszustand ein einzelner Peak erzeugt. Die Gesamtbreite wird durch Kombination der Peakbreite des Geräts mit der theoretischen Breite der Isotopenhülle geteilt durch die Anzahl der Ladungen des Ions bestimmt. Die Peakbreite des Geräts würde am ersten Isotopenpeak einer niedermolekularen Verbindung mit demselben m/z-Wert wie der mehrfach geladene Proteinpeak bestimmt werden.

Wie viel Genauigkeit brauchen wir bzw. können wir realistischerweise erreichen, und welche Kompromisse müssen wir eingehen?

Beachten Sie die Anforderungen für eine eindeutige Charakterisierung aus den Autorenrichtlinien des Journal of the American Society for Mass Spectrometry (März 2004). Für C-, H-, O-, N-Zusammensetzungen (C_0-100, H_3-74, O_0-4 und N_0-4) benötigt ein nominales Masse-Ladungs-Signal bei 118 nur einen Fehler von nicht mehr als 34 ppm, um eindeutig zu sein, während ein m/z-Signal bei 750 eine Präzision von besser als 0,018 ppm erfordert, um „alle eingeschleppten Möglichkeiten“ auszuschließen.

Vergleich der Präzision von Gerät zu Gerät: Millimasseinheiten (mmu), Messfehler (ppm) und Auflösung

Laut dem Accurate Mass Best Practice Guide des VIMMS-Programms, einer Initiative des britischen National Measurement Systems, können die meisten für akkurate Massenmessungen verwendeten Geräte eine Genauigkeit von 10 ppm oder besser erreichen.

Eine berechnete Masse von 118 Da, die von einem modernen Massenspektrometer mit einer Genauigkeit von 2 mmu gemessen wird, würde einen Fehler von 17 ppm aufweisen, was nach heutigen Maßstäben für die eindeutige Bestimmung einer chemischen Formel dieser Masse ausreicht:

Monoisotopisch berechnete exakte Masse = 118 Da

Gemessene genaue Masse = 118,002 Da

Differenz = 0,002 mmu

Fehler [Differenz/exakte Masse x 106] = 17 ppm

Ein Gerät, das bei 750 m/z reagieren kann, ebenfalls mit einem Mangel von 2 mmu, wäre auf 2,7 ppm genau. Im ersten Fall ist die Messung mehr als ausreichend für die eindeutige Identifizierung einer chemischen Formel, entsprechend den veröffentlichten Standards des Journal of The American Society for Mass Spectrometry. Im letzteren Fall ist die Messung jedoch nicht präzise genug. Nur die Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie (FTICR) höchster Ordnung kann eine solche Präzision bei höheren Massen erreichen.

Eine umfassende Methode zur Bewertung der Genauigkeit der Massenmessung eines Geräts, die der beabsichtigten Verwendung entspricht, ist die Berechnung des quadratischen Mittelwerts oder RMS-Fehlers. Zur Veranschaulichung der Anwendung wird im Folgenden die Spezifikation der Massenmessgenauigkeit eines handelsüblichen ToF-Massenspektrometers verwendet.

„Die Massenmessgenauigkeit des Geräts ist unter normalen Betriebsbedingungen besser als ein bestimmter ppm RMS über den bestimmten m/z-Bereich, basierend auf einer Anzahl von aufeinanderfolgenden Wiederholungsmessungen eines Analytpeaks (mit bestimmtem m/z), unter Verwendung eines geeigneten Referenz-Peaks (mit bestimmtem m/z). Analyt- und Referenz-Peaks müssen eine ausreichende Intensität aufweisen und frei von Störungen durch andere Massen sein.“

Es gibt einige wichtige Punkte und Annahmen, die berücksichtigt werden müssen:

1. Eine Gerätekalibrierung wurde bereits mit Peaks bekannter Masse unter Verwendung eines Kalibrierstandards durchgeführt. Der Referenz-Peak wird verwendet, um etwaige Schwankungen der Gerätekalibrierung im Laufe der Zeit auszugleichen, und die Genauigkeit der Massenmessung wird anhand des Peaks des Analyten bestimmt.
2. Normale Betriebsbedingungen – können auch Angaben zu chromatographischen Bedingungen (für LC/MS-Leistungsdaten) und allen damit verbundenen MS-Betriebsbedingungen (z. B. Massenauflösung, interessierendes m/z oder spektrale Aufnahmerate) enthalten.
3. Ausreichende Intensität – setzt voraus, dass die Ionenzahl die Charakterisierung der (Massenmessungs-)Genauigkeit und Präzision des betreffenden Geräts nicht beeinträchtigt. Zu wenige Ionen führen zu einer schlechten Ionenstatistik und zu viele Ionen können zu einer Sättigung des Detektors führen. Beides führt zu einer größeren Schwankung der Standardabweichung bei Wiederholungsmessungen und beeinflusst die Berechnung des RMS-Fehlers (auch für die Kalibrierung des Geräts relevant) negativ.
4. Störungsfrei – geht davon aus, dass die Massenmessung des Peaks mit bekannter Masse frei von Störungen durch Ionen gleicher oder ähnlicher Masse ist. Überlappende Peaks führen zu einer schlechten Genauigkeit der Massenmessung, was sich auch nachteilig auf die korrekte Charakterisierung der Genauigkeit oder Präzision des Geräts auswirkt (auch relevant für die Gerätekalibrierung).
5. Die Referenz ist eine gute Darstellung des m/z-Bereichs, der für die Analyse eines bestimmten Probentyps relevant ist.

Der RMS-Fehler wird anhand der folgenden Beziehung berechnet, wobei E_ppm der ppm-Fehler und n die Anzahl der betrachteten Massen ist:

Es sei darauf hingewiesen, dass der RMS-Fehler es zulässt, dass einige Messungen außerhalb des „interessierenden“ ppm-Fehlerfensters liegen (z. B. 5 ppm RMS). Um die Qualität der Messungen zu gewährleisten, müssen die oben beschriebenen Bedingungen (insbesondere hinsichtlich der Intensität und des Einflusses von Interferenzen – ausgewogene Ionenstatistik mit klarer Peakdefinition in den Spektren) über eine Reihe von Wiederholungsinjektionen erfüllt sein. Viele der angegebenen Zahlen zur Auflösung und Massengenauigkeit sind keine RMS-Fehlerzahlen, sondern stammen von einem einzigen ausgewählten (günstigen) Ion.

Bei allen Applikationen ist zu bedenken, dass ein schwaches Signal (zu hohe Auflösung) eine schlechte Ionenstatistik ergeben kann und daher unbrauchbar ist. Ein zu starkes Signal kann ebenso nutzlos sein und eine Sättigung des Detektors verursachen. Das Ziel ist eine ausgewogene Ionenstatistik mit definierten Spektren.

Einige Vergleiche in Bezug auf die Abbildung:

• Die Quadrupol-Auflösung reicht nicht aus, um die beiden Verbindungen in der oberen Abbildung zu unterscheiden
• Mit einem Auflösungsvermögen von ~5000 zeigen die ToF-Daten deutlich zwei unterschiedliche Peaks, die auf < 5 ppm genau gemessen werden können

Es ist wichtig, die verschiedenen miteinander verknüpften Rollen zu verstehen, die die Verschiebung zwischen den Massendefinitionen und die zunehmende Auflösung sowie Faktoren wie Peakform und die Notwendigkeit der Kalibrierung für die Präzision der Masse spielen. Wenn diese nicht klar verstanden und berücksichtigt werden, kann es zu Fehleinstufungen und anderen unerwünschten Ergebnissen kommen.

Die beiden Fragmente unterschiedlicher Zusammensetzung in der Abbildung stammen von demselben Analyten und sind daher zur gleichen Zeit in der Quelle. Selbst die beste Chromatographie hilft in diesem Fall nicht weiter. Dies unterstreicht einen der Gründe, warum eine höhere Auflösung vor allem bei der Analyse von Unbekannten nützlich ist. Dies gilt gleichermaßen für QTof-Produktionendaten und Produktionendaten aus einem Triple-Quad. Ein zusätzlicher Vorteil dieses höheren Auflösungsgrades ist, dass der extrahierte Ionenstrom (XIC) der einzelnen Chromatogramme eine selektive Unterscheidung der sauerstoffhaltigen und alkylhaltigen Analyten ermöglicht, während dies bei den Quad-Daten nicht möglich ist.

Siehe MS – The Practical Art, LCGC 

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol. 22 No. 2, S. 118 – 130, Februar 2004
  • Warum dies wichtig ist: Behandelt viele der Fragen, die im Mittelpunkt der praktischen Aspekte der Nutzung stehen, sowie Vergleiche aus Industriequellen
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol. 26, No. 3, März 2008
  • Warum dies wichtig ist: Erörtert den Nutzen der Geräte mit der höchsten Auflösung und vergleicht sie mit realistischen Erwartungen

Siehe auch:

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004). VIMMS 2004 guidance document
  • Warum dies wichtig ist: Ein kurzer und prägnanter Überblick über die Themen, die für den Erfolg von gemessener, genauer Massenarbeit entscheidend sind
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie und D. A Volmer, Spectroscopy, Vol. 22, No. 6, Juni 2007
  • Warum dies wichtig ist: Erweitert das Grundlagenthema um den Kendrick-Massendefekt und die Kennzeichnung für Peptide und Proteine

Sulfamethazin Nennwert = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Durchschnittliche Masse – Berechnet anhand aller Isotope der einzelnen Elemente und ihrer natürlichen Häufigkeit.

Sulphamethazin durchschn. Masse = 278,3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Berechnete genaue Masse – (monoisotopisch) Bestimmt durch Summierung der Massen der einzelnen Isotope für ein bestimmtes Ion

Sulfamethazin exakte Masse = 278,0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Genaue Masse - (Eigentlich „gemessene genaue Masse“) Was wir mit unseren Geräten machen. Es ist das Maß eines m/z, das mit (typischerweise) drei oder vier Nachkommastellen angegeben wird.

Mit zunehmender Masse werden die Unterschiede zwischen den Definitionen größer, und die Peakform spielt eine größere Rolle:

Ubiquitin Nominaler genauer Durchschnitt

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560,6254 8565,8730