Der Leitfaden zur Massenspektrometrie

Was ist Massenspektrometrie und was steckt dahinter?

Massenspektrometer können kleiner als eine Münze sein, oder auch sehr große Räume füllen. Obwohl die verschiedenen Gerätetypen für sehr unterschiedliche Applikationen eingesetzt werden, haben sie doch bestimmte Betriebsgrundlagen gemeinsam. Als Maßeinheit hat sich das Dalton (Da) durchgesetzt und andere Begriffe wie amu verdrängt. 1 Da = 1/12 der Masse eines einzelnen Atoms des Isotops von Kohlenstoff 12 (¹²C).

Einst wurden Massenspektrometer ausschließlich als qualitative Geräte eingesetzt – als Hilfsmittel bei der Bestimmung der Identität von Verbindungen – und galten als unfähig, eine strenge Quantifizierung durchzuführen. In jüngerer Zeit haben sie sich jedoch sowohl als qualitative als auch als quantitative Geräte bewährt.

Ein Massenspektrometer kann die Masse eines Moleküls erst messen, nachdem es das Molekül in ein Gasphasen-Ion umgewandelt hat. Dazu lädt es die Moleküle elektrisch auf und wandelt den daraus resultierenden Fluss elektrisch geladener Ionen in einen proportionalen elektrischen Strom um, der dann von einem Datensystem abgelesen wird. Das Datensystem wandelt den Strom in digitale Informationen um und zeigt sie als Massenspektrum an.

a) Die zunehmende Häufigkeit des Gesamtionenstroms (Total Ion Current, TIC) wird in einer chromatografieähnlichen Kurve dargestellt und zeigt, wie sie sich im Laufe der Zeit verändert. b) Jede digitale Scheibe eines Peaks stellt die Ionen dar, die zu diesem Zeitpunkt den Ionenstrom bilden, der oft als Profil- oder Kontinuumsaufnahme bezeichnet wird. Die x- oder „Zeit“-Achse ist nun das Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z), und die Fähigkeit, benachbarte Ionen im Spektrum aufzulösen (z. B. Isotope), ist leicht zu erkennen. c) Ein Profilspektrum wird oft auf einen „Stabplot“ reduziert, der durch Zentroide dargestellt wird, die von jedem Peakscheitelpunkt abgesetzt werden, wodurch die Größe der gespeicherten Datei zugunsten der Informationen mit höherer Auflösung verringert wird.

Ionen können auf verschiedene Arten erzeugt werden, die auf den jeweiligen Zielanalyten abgestimmt sind:

Durch Laserablation einer in einer Matrix gelösten Verbindung auf einer ebenen Oberfläche, z. B. durch MALDI
Durch Wechselwirkung mit einem erregten Partikel oder Elektron wie bei der Elektronen-Ionisierung (EI)
Als Teil des Transportprozesses selbst; Bei Elektrospray (ESI) wird der Eluent aus einem Flüssigchromatographen einer Hochspannung ausgesetzt, wodurch Ionen aus einem Aerosol entstehen

Die Ionen werden entsprechend ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) getrennt, nachgewiesen und gemessen. Der relative Ionenstrom (das Signal) wird gegen das m/z aufgetragen, wodurch ein Massenspektrum entsteht. Kleine Moleküle haben in der Regel nur eine einzige Ladung: Das m/z hat daher eine Masse (m) über 1. Dabei ist „1“ ein Proton, das bei der Ionisierung hinzugefügt wird [dargestellt als M+H+ oder M-H-, wenn es durch den Verlust eines Protons gebildet wird] oder, wenn das Ion durch den Verlust eines Elektrons gebildet wird, als das Radikalkation [M+.]. Die Genauigkeit eines Massenspektrometers bzw. die Genauigkeit, mit der es die tatsächliche Masse messen kann, kann variieren, wie in späteren Abschnitten dieses Leitfadens erläutert wird.

Größere Moleküle fangen Ladungen an mehr als einer Stelle innerhalb ihrer Struktur ein. Kleine Peptide haben in der Regel zwei Ladungen (M+2H+), während sehr große Moleküle zahlreiche Stellen haben, die es ermöglichen, mit einfachen Algorithmen die Masse des im Spektrum dargestellten Ions zu bestimmen.

Geräte mit geringer Auflösung können bei ordnungsgemäßer Kalibrierung außergewöhnlich genaue Massen liefern, aber je mehr Daten sich ansammeln, desto weniger Informationen liefert ihr begrenzter Auflösungsraum über das Spektrum. Ein gemeinsames metabolisches Fragment (BK1-5 oder Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) von Bradykinin, einem 9-Aminosäure-Peptid, ACE (Angiotensin Converting Enzyme)-Hemmer, der zur Erweiterung von Blutgefäßen verwendet wird, kann zwei Ladungen tragen (eine einfache Ladung oder M+H ergibt den monoisotopischen Wert 573,3149, während die doppelt geladene Version oder M+2H 287,1614 anzeigt). Die Isotope sind ebenfalls doppelt geladen und beginnen den verfügbaren Auflösungsraum auszufüllen.

Welche Molekülgrößen kann ich analysieren?

Die Desorptionsmethoden (die in diesem Leitfaden beschrieben werden) haben die Möglichkeiten zur Analyse großer, nicht flüchtiger und empfindlicher Moleküle erweitert. Die routinemäßige Erkennung von 40000 Da mit einer Genauigkeit von 0,01 % (oder 4 Da) ermöglicht die Bestimmung kleinerer Veränderungen, wie z. B. posttranslationaler Modifikationen. Mehrfache Ladungen erweitern den Bereich des Massenspektrometers weit über die vorgesehene Obergrenze hinaus auf Massen von 1000000 Da oder mehr.

Isotopen- und Elementmassenspektrometrie

Die natürliche Isotopenhäufigkeit ist gut charakterisiert. Obwohl sie oft als stabil angesehen wird, kann sie dennoch signifikante und charakteristische Schwankungen aufweisen. Messungen des Isotopenverhältnisses werden sowohl in Stoffwechselstudien (isotopenangereicherte Elemente dienen als Tracer) als auch in Klimastudien verwendet, bei denen temperaturabhängige Sauerstoff- und Kohlenstoffänderungen gemessen werden. In der Praxis werden komplexe Moleküle in einfache molekulare Komponenten zerlegt, bevor sie mithilfe von hochpräzisen Messgeräten, wie z. B. Magnetsektorgeräten, gemessen werden (siehe folgender Abschnitt).

Die Elementaranalyse wird in der Regel an anorganischen Materialien – zur Bestimmung der Elementzusammensetzung, nicht der Struktur – und in einigen Fällen unter Verwendung von festen Metallproben durchgeführt. Induktiv gekoppelte Plasmaquellen (ICP) sind üblich, bei denen ein Gerät zur Entladung (oder Glimmentladung mit geringerer Leistung) die Probe ionisiert. Der Nachweis mit speziellen Geräten im Bereich von Teilen pro Billion ist nicht ungewöhnlich.