Leitfaden für Einsteiger zur Flüssigchromatographie

Die Flüssigchromatographie (LC) wurde Anfang des 20. Jahrhunderts durch den russischen Botaniker Mikhail S. Tswett definiert. Seine bahnbrechenden Studien konzentrierten sich auf die Trennung von Verbindungen [Blattpigmenten], die mit einem Lösungsmittel aus Pflanzen extrahiert wurden, in einer mit Partikeln gepackten Säule.

Tswett füllte eine offene Glassäule mit Partikeln. Zwei spezielle Materialien, die er für nützlich hielt, waren Kreidepulver [Calciumcarbonat] und Aluminiumoxid. Er goss seine Probe [Lösungsmittelextrakt aus homogenisierten Pflanzenblättern] in die Säule und ließ sie durch das Partikelbett laufen. Es folgte reines Lösungsmittel. Als die Probe aufgrund der Schwerkraft die Säule nach unten durchlief, konnte man feststellen, dass sich verschiedenfarbige Banden trennten, da sich einige Komponenten schneller bewegten als andere. Er ordnete diese getrennten, verschiedenfarbigen Banden den verschiedenen Verbindungen zu, die ursprünglich in der Probe enthalten waren. Er hatte eine analytische Trennung dieser Verbindungen erstellt, basierend auf der unterschiedlichen Stärke der chemischen Anziehungskraft jeder Verbindung durch die Partikel. Die Verbindungen, die von den Partikeln stärker angezogen wurden, wurden langsamer, während andere Verbindungen, die vom Lösungsmittel angezogen wurden, sich schneller bewegten. Dieser Prozess kann wie folgt beschrieben werden: Die in der Probe enthaltenen Verbindungen verteilen sich unterschiedlich zwischen dem sich bewegenden Lösungsmittel, der mobilen Phase, und den Partikeln, der stationären Phase. Dadurch bewegt sich jede Verbindung mit einer anderen Geschwindigkeit, wodurch eine Trennung der Verbindungen entsteht.

Tswett prägte den Namen Chromatographie [von den griechischen Wörtern chroma, Farbe, und graph, was Schreiben bedeutet – wörtlich: Farbschrift], um sein farbenprächtiges Experiment zu beschreiben. [Interessanterweise bedeutet der russische Name Tswett Farbe.] Heutzutage ist die Flüssigchromatographie in ihren verschiedenen Formen zu einem der leistungsstärksten Werkzeuge der analytischen Chemie geworden. 

Technik 2. In Abbildung C sind Proben auf Papier aufgetupft [stationäre Phase]. Das Lösungsmittel [mobile Phase] wird dann in der Mitte des Spots hinzugefügt, um einen radialen Fluss nach außen zu erzeugen. Dies ist eine Form der Papierchromatographie. [Die klassische Papierchromatographie wird auf ähnliche Weise wie TLC mit linearem Fluss durchgeführt.] Im oberen Bild wird dieselbe schwarze FD&C-Farbstoffprobe auf das Papier aufgetragen.

Beachten Sie den Unterschied in der Trennleistung bei diesem speziellen Papier im Vergleich zur TLC-Platte. Der grüne Ring zeigt an, dass das Papier die gelben und blauen Farbstoffe nicht voneinander trennen kann, diese Farbstoffe jedoch von den roten Farbstoffen trennen kann. Im unteren Bild wurde eine grüne Probe, die aus den gleichen gelben und blauen Farbstoffen besteht, auf das Papier aufgetragen. Wie zu erwarten, kann das Papier die beiden Farbstoffe nicht trennen. In der Mitte wurde eine violette Probe, bestehend aus roten und blauen Farbstoffen, auf das Papier aufgetragen. Diese wurden gut getrennt.

Technik 3. Bei diesem leistungsstärksten Ansatz durchläuft die Probe eine Säule oder Kartuschenvorrichtung, die geeignete Partikel enthält [stationäre Phase]. Diese Partikel werden chromatographisches Packungsmaterial genannt. Das Lösungsmittel [mobile Phase] fließt durch die Kartusche. Bei der Festphasenextraktion [SPE] wird die Probe in die Kartusche geladen und der Lösungsmittelstrom trägt die Probe durch das Gerät. Wie in Tswetts Experiment werden die Verbindungen in der Probe dann getrennt, indem sie sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gerät bewegen. Hier wird die schwarze Probe in eine Kartusche geladen. In jedem Schritt werden unterschiedliche Lösungsmittel verwendet, um die Trennung zu erzeugen.

Wenn das Kartuschenformat verwendet wird, gibt es mehrere Möglichkeiten, einen Fluss zu erreichen. Schwerkraft oder Vakuum können für Säulen verwendet werden, die keinem Druck standhalten. In der Regel haben die Partikel in diesem Fall einen größeren Durchmesser [> 50 Mikron], damit der Fluss weniger Widerstand hat. Offene Glassäulen [Tswetts Experiment] sind ein Beispiel dafür. Darüber hinaus können kleine Kunststoffsäulen, normalerweise in Form von Spritzenzylindern, mit Partikeln des Packungsmaterials gefüllt und zur Probenvorbereitung verwendet werden. Dies wird Festphasenextraktion [SPE] genannt. Hierbei wird als Chromatographiegerät eine Kartusche mit normalerweise vakuumunterstütztem Fluss verwendet, um eine sehr komplexe Probe vor der weiteren Analyse aufzureinigen.

Zur Verbesserung der Trennleistung sind kleinere Partikelgrößen [< 10 Mikron] erforderlich. Kleinere Partikel haben jedoch einen größeren Flusswiderstand, sodass höhere Drücke erforderlich sind, um die gewünschte Flussrate des Lösungsmittels zu erzeugen. Es sind Pumpen und Säulen erforderlich, die für hohe Drücke ausgelegt sind. Wenn das Lösungsmittel mit mäßigem bis hohem Druck durch die Chromatographiesäule geleitet wird, spricht man von HPLC.

Was ist High Performance Liquid Chromatography (HPLC)?

Das Akronym HPLC, das vom verstorbenen Prof. Csaba Horváth für seine Arbeit in Pittcon 1970 geprägt wurde, wies ursprünglich darauf hin, dass zur Erzeugung des für die Flüssigchromatographie in gepackten Säulen erforderlichen Flusses Hochdruck verwendet wurde. Anfangs hatten Pumpen nur einen Druck von 500 psi [35 bar]. Dies wurde Hochdruck-Flüssigchromatographie oder HPLC genannt. Anfang der 1970er Jahre kam es zu einem enormen Technologiesprung. Diese neuen HPLC-Geräte konnten einen Druck von bis zu 6000 psi [400 bar] entwickeln und enthielten verbesserte Injektoren, Detektoren und Säulen. Die HPLC setzte sich Mitte bis Ende der 1970er Jahre durch. Mit kontinuierlichen Fortschritten bei der Leistung während dieser Zeit [kleinere Partikel, noch höherer Druck] blieb die Abkürzung HPLC gleich, der Name wurde jedoch in High Performance Liquid Chromatography (Hochleistungs-Flüssigchromatographie) geändert.

Die Hochleistungs-Flüssigchromatographie ist heute eines der leistungsstärksten Werkzeuge in der analytischen Chemie. Sie kann die Verbindungen, die in jeder Probe, die in einer Flüssigkeit gelöst werden kann, vorhanden sind, trennen, identifizieren und quantifizieren. Heutzutage können Verbindungen in Spurenkonzentrationen bis hin zu Teilen pro Trillion [ppt] leicht identifiziert werden. Die HPLC kann auf fast jede Probe angewendet werden (und wurde dies auch bereits), wie z. B. auf Pharmazeutika, Lebensmittel, Nutrazeutika, Kosmetika, Umweltmatrizes, forensische Proben und Industriechemikalien.

Was ist UltraPerformance Liquid Chromatography (UPLC-Technologie)?

Im Jahr 2004 wurden weitere Fortschritte in der Geräte- und Säulentechnologie erzielt, um die Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit der Flüssigchromatographie deutlich zu verbessern. Säulen mit kleineren Partikeln [1,7 Mikron] und Geräte mit speziellen Fähigkeiten, die entwickelt wurden, um eine mobile Phase bei 15.000 psi [1000 bar] zu liefern, wurden benötigt, um ein neues Leistungsniveau zu erreichen. Für die Ultra-Performance-Flüssigchromatographie musste ganzheitlich ein neues System entwickelt werden, das heute als UPLC-Technologie bekannt ist.

Die Grundlagenforschung wird heute von Wissenschaftlern vorgenommen, die mit Säulen arbeiten, die noch kleinere Partikel mit einem Durchmesser von 1 Mikrometer enthalten, und mit Geräten, die bei 100.000 psi [6800 bar] arbeiten können. Dies gibt einen Einblick in das, was uns in der Zukunft erwartet.