Präparative Flüssigchromatographie – Leitfaden

1. Trennung von Antioxidantien mithilfe des Prep 150 LC Systems
2. Peptidtrennung mithilfe des Prep 150 LC Systems
3. Aufreinigung von Cannabinoiden aus Hanföl mithilfe des Prep 150 LC Systems
4. Trennung von Flavonoiden aus Ginko-Biloba-Blättern mithilfe des Waters Prep 150 LC Systems
5. Trennung eines Naturstoffs aus Echinaceaextrakt mithilfe des Prep 150 LC Systems
6. Automatische Optimierung der Trennung von Verbindungen mit UPLC zu präparativer Chromatographie mithilfe von massengesteuerter AutoPurification
7. Massengesteuerte Trennung eines synthetischen Peptids mithilfe des ACQUITY QDa Detektors
8. Strategien zur Verbesserung der Trennung unter Verwendung großer Volumina und einer einfachen Methodenentwicklung in der präparativen Chromatographie
9. Techniken zur Verbesserung der Effizienz der Beladung mit großen Volumina in der präparativen Flüssigchromatographie
10. Massengesteuerte Trennung von Sulfaverbindungen aus einer Antibiotikamischung mithilfe des ACQUITY QDa Detektors
11. Massengesteuerte Trennung pharmazeutischer Verbindungen mithilfe von AutoPurify mit einem ACQUITY QDa Detektor
12. Typische Bedingungen für die Analyse und Trennung von Verbindungen im Mischungsstandard der präparativen Chromatographie mit einem ACQUITY QDa Detektor
13. Präparative Chromatographie von Naturstoffextrakten unter Verwendung einer UV-basierten Open Access Walk-up Aufreinigungsstrategie
14. Ein modulares präparatives HPLC-System zur Trennung von Puerarin aus Kudzu-Wurzelextrakten
15. Systematische Verbesserung der Auflösung und Beladung der Säule in der präparativen Flüssigchromatographie zur Trennung einer Nebenkomponente aus Pfefferminzextrakt
16. Trennung von Peptiden und Verunreinigungen im kleinen Maßstab mit dem ACQUITY UPLC H-Class System und den Waters Fraktionsmanager -Analytischen Systemen
17. Aufreinigung von Bestandteilen komplexer Naturstoffextrakte im kleinen Maßstab mit ACQUITY H-Class und Waters Fraktionsmanager -Analytische Systeme
18. Verdünnung an der Säule, Applikationshinweise, Revision A, Waters Corp, 2003. Für weitere Informationen über nützliche Applikationshinweise und Referenzen besuchen Sie bitte www.waters.com und geben Sie die blauen Referenznummern oben in das Suchfeld ein. 

ZUSAMMENFASSUNG:

• Verdünnung an der Säule – Patentierte Injektionstechnik, die die Massenkapazität erhöht, die Auflösung verbessert, die Lebensdauer der Säule erhöht und die Robustheit des LC-Systems verbessert, indem die Probe in einem starken Lösungsmittel am Kopf der Säule verdünnt wird. Chromatogramm – Eine grafische oder andere Darstellung des Detektorsignals oder einer anderen Größe, die als Maß für die Konzentration des Analyten im Ablauf gegen das Ablaufvolumen oder die Zeit verwendet wird. Säulenvolumen (V_c), V_c = π x (r)² x Höhe x 66 % verfügbar für mobile Phase/1000 zur Umrechnung von mm³ in mL – Das geometrische Volumen des Teils der Kapillare, der die Packung enthält (innere Querschnittsfläche der Kapillare multipliziert mit der gepackten Bettlänge, L, mit Kompensation des vom Packungsmaterial eingenommenen Raums, 66 %), auf einem kleinen Teil des Flusses zum Detektor, während der Hauptteil zum Fraktionssammler geht. Wenn die Komponenten der mobilen Phase für isokratische Trennungen online gemischt werden, ist das Dwell-Volumen immer noch vorhanden. Da die Konzentration der mobilen Phase jedoch konstant ist, ist bei der Chromatographie kein Unterschied feststellbar. Eluat, Eluent, Eluieren – Eluat bezieht sich auf den Anteil des Eluenten, der aus dem Säulenauslass austritt oder eluiert und die Analyten in Lösung enthält. Bei der analytischen HPLC wird das Eluat vom Detektor auf die Konzentration oder Masse der darin enthaltenen Analyten untersucht. Bei der präparativen HPLC wird das Eluat kontinuierlich in Aliquote zu gleichförmigen Zeit- oder Volumenintervallen oder diskontinuierlich nur dann gesammelt, wenn ein Detektor das Vorhandensein eines interessierenden Peaks anzeigt. Diese Fraktionen werden anschließend zu aufgereinigten Verbindungen verarbeitet. Hydrophob – Eine Eigenschaft, die unpolare Radikale oder Moleküle besitzen, die in organischen Lösungsmitteln besser löslich sind als in Wasser. Ionenaustauschchromatographie – Die Ionenaustauschchromatographie (oder Ionenchromatographie) ist ein Chromatographieverfahren, das Ionen und polare Moleküle basierend auf ihrer Affinität zum Ionenaustauscher trennt. Trenntechniken werden für alle Arten geladener Moleküle wie große Proteine, kleine Nukleotide und Aminosäuren verwendet. Isokratisch – Die Zusammensetzung der mobilen Phase bleibt während einer chromatographischen Trennung konstant. Zusatzlösungsmittel – Lösungsmittel, das zum Verdünnen der aufgespaltenen Probe und zum Transferieren von Proben aus dem Präparationsstrom zu den Detektoren in einem massengesteuerten Aufreinigungssystem verwendet wird. Mobile Phase – Lösungsmittel, die zur Elution von Verbindungen von einer HPLC-Säule verwendet werden. Flussrate – Volumen der mobilen Phase, das in einer Zeiteinheit durch die Säule fließt. Injektor (Autosampler, Sample Manager) – Ein Mechanismus zum genauen und präzisen Einführen (Injizieren) eines vorher bestimmten Volumens einer Probenlösung in den fließenden Strom der mobilen Phase. Isokratische Elution – Die Zusammensetzung der mobilen Phase bleibt während der Elution konstant. Mobile Phase – Flüssigkeit, die sich in einer bestimmten Richtung durch das Sorbensbett der stationären Phase bewegt. Peak – Aufzeichnung des Detektorsignals, während eine einzelne Komponente von der Säule eluiert wird. Auflösung (Rs) – Die Trennung zweier Peaks ist das Ergebnis aus der Differenz ihrer zugehörigen Retentionszeiten, geteilt durch ihre durchschnittliche Peakbreite auf der Basislinie. R_s = 1,25 gibt an, dass zwei Peaks gleicher Breite gerade an der Basislinie getrennt sind. Bei R_s = 0,6 ist der einzige visuelle Hinweis auf das Vorhandensein von zwei Peaks in einem Chromatogramm eine kleine Kerbe in der Nähe des Peakscheitelpunkts. Retentionszeit (RT) – Zeit zwischen dem Start der Injektion oder der Probeneinführung und dem Auftreten des Peakmaximums. Selektivität – Ein Begriff, der verwendet wird, um die Größe der Differenz zwischen den relativen Affinitäten eines Analytpaares für die angegebene mobile und stationäre Phase zu beschreiben, aus denen das Separations-/Trennsystem besteht. Maßstab (Scale-up) – Die gewünschte Menge an aufgereinigtem Isolat pro Trennung bestimmt den Maßstab und den Säulendurchmesser sowie die System- und Hardwareanforderungen. Die Menge kann von der Trennung oder Aufreinigung kleiner µg-Mengen an Enzymen bis hin zu großen kg-Mengen reichen, die für die industrielle Arzneimittelherstellung erforderlich sind. Das Scale-up ist die Erzeugung größerer Mengen einer bestimmten Verbindung zur weiteren Auswertung nach einer anfänglichen Demonstration des potenziellen Werts. Stufengradient – Trennmethode, die die Steigung vor und nach einem flachen, fokussierten Teil des Gradienten beibehält, wodurch das Chromatographieprofil für diese Teile der Trennung beibehalten wird. Silanol – Chemische Gruppe, die an das Packungsmaterial der Silika-Substratsäule gebunden ist und für die Interaktion mit der Probe zur Verfügung steht. Splitter – Wird verwendet, um einen kleinen Teil des Probenstroms zu einem nicht-zerstörungsfreien Detektor umzuleiten, z. B. bei der Aufreinigung mit Massenspektrometrie. Stationäre Phase – Ein poröser Feststoff (z. B. Glas, Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid), der in ein Glas- oder Metallröhrchen gepackt ist oder in eine offene Kapillare; mobile Phase fließt durch das gepackte Bett oder die Säule, die zu trennende Probe wird am Anfang der Säule injiziert und von der mobilen Phase durch das System transportiert; verschiedene Substanzen verteilen sich entsprechend ihrer relativen Affinität zu den beiden Phasen. Durchsatz – Vorteil des Betriebs von LC-Trennungen bei höheren linearen Geschwindigkeiten unter Verwendung von analytische Trennsäulen mit kleinerem Volumen mit kleineren Partikeln oder großvolumigen, präparativen Säulen mit großen Partikeln; höhere Auflösung, höhere Geschwindigkeit und höhere Effizienz liefern in der Regel einen höheren Durchsatz; größere Mengen der Verbindung können pro Lauf oder Prozessierungszeitraum aufgereinigt werden.

GLOSSAR

1. Systemvolumen – Dwell-Volumen, Verzögerungsvolumen, Systemvolumen vom Mischen der mobilen Phasen bis zum Erreichen des Säulenkopfes; bei Hochdruck-LC-Mischsystemen umfasst dies den Mischer, die Verbindungsleitungen und die Autosampler-Schleife als Hauptkomponenten, die nur für Gradientenapplikationen von Bedeutung sind.
2. Split-Verhältnis – Die Menge an Material, die während der massengesteuerten Aufreinigung kontinuierlich aus dem Probenstrom „entfernt“ und verdünnt wird, bevor sie zu den Detektoren übertragen wird.
3. Ausschlusschromatographie – Chromatographische Trennung von Verbindungen nach ihrer Größe in der Lösung.
4. Flacher Gradient – Gradient, bei dem die Änderungsrate der Konzentration des organischen Lösungsmittels pro Säulenvolumen gering ist. Er wird zur Trennung von Verbindungen mit ähnlicher Affinität für die Säulenmatrix verwendet.
5. Segmentierter Gradient – Trennmethode, die mehrere Gradienten mit unterschiedlichen Steigungen umfasst, um mehrere Verbindungen mit unterschiedlicher Selektivität mit höchstem Durchsatz zu trennen.
6. Empfindlichkeit (S) – Signalausgabe pro Konzentrations- oder Masseneinheit einer Substanz in der mobilen Phase, die in den Detektor eintritt; bei massendurchflussempfindlichen Detektoren ist dies das Verhältnis der Peakhöhe zur Masseneinheit.
7. Umkehrphasenchromatographie – Elutionsverfahren der Flüssigchromatographie, bei dem die mobile Phase deutlich polarer ist als die stationäre Phase.
8. Retentionsfaktor (k) – Ein Maß für die Verweilzeit der Probenkomponente in der stationären Phase im Verhältnis zur Verweilzeit in der mobilen Phase; es drückt aus, wie viel länger eine Probenkomponente durch die stationäre Phase verzögert wird, als es dauern würde, um mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase die Säule zu durchlaufen.
9. Präparative Chromatographie – Der Prozess der Verwendung von Flüssigchromatographie zur Trennung einer Verbindung in einer Menge und einem Reinheitsgrad, die für weitere Experimente oder Applikationen ausreichen.
10. Passiver Splitter – Gerät zur kontinuierlichen Messung des Hauptflusses oder des präparativen Stroms mit einem definierten Splitverhältnis; steuert das Detektorsignal bei der massengesteuerten Aufreinigung.
11. Flüssigchromatographie (LC) – Eine Trenntechnik, bei der die mobile Phase flüssig ist.
12. Einlass – Der Eingang des Säulenbetts, an dem der Strom der mobilen Phase und die Probe eintreten.
13. Gradient – Die zeitliche Änderung der relativen Konzentrationen von zwei (oder mehr) mischbaren Lösungsmittelkomponenten, die eine mobile Phase mit zunehmender Elutionsstärke bilden.
14. Modifikator der mobilen Phase – Additive, die den chromatographischen Lösungsmitteln beigemischt werden, um die Trennung zu verbessern.
15. Massenkapazität – Auch „Massenlast“ genannt; maximale Materialmenge, die auf eine Säule injiziert werden kann und bei der die Auflösung der interessierenden Verbindung angemessen erhalten bleibt.
16. Linearer Gradient – Chromatographische Trennmethode, bei der die Zusammensetzung der mobilen Phase über einen definierten Zeitraum mit konstanter Rate geändert wird.
17. Ionisierung – Prozess, bei dem ein Molekül eine negative oder positive Ladung annimmt, indem es Elektronen aufnimmt oder verliert, um Ionen zu bilden.
18. Hydrophil – Löst oder reagiert leicht mit Wasser oder polaren Lösungsmitteln aufgrund der starken polaren Gruppen.
19. Äquilibrierung – Bei chromatographischen Methoden, bei denen ein Gradient verwendet wird, ist nach dem Lauf eine Äquilibrierungszeit erforderlich, um die Säule und das System vor der nächsten Injektion wieder auf die ursprünglichen Bedingungen der mobilen Phase einzustellen. Um eine ausreichende Äquilibrierung zu erreichen, sollte die Säule mit dem 5-fachen Säulengesamtvolumen (CV) plus dem 3-fachen Systemvolumen (Dwell) bei den Startbedingungen der Methode gespült werden. Gradientenchromatographie, Säulen-Neuäquilibrierung, Leistungsperspektiven, Waters Corp. 1998. Gradientensteigung – Änderungsrate der organischen Lösungsmittelzusammensetzung pro Säulenvolumen während einer Gradiententrennung.
20. Effizienz – Ein Maß für die Fähigkeit einer Säule, der Dispersion einer Probenbande beim Passieren der Säule zu widerstehen. Eine effiziente Säule minimiert die Bandendispersion bzw. Bandenverbreiterung. Eine höhere Effizienz ist für eine effektive Trennung, höhere Empfindlichkeit und/oder Identifizierung ähnlicher Komponenten in einer komplexen Probenmischung wichtig.
21. Dwell-Volumen – Systemvolumen vom Mischen der mobilen Phasen bis zum Erreichen des Säulenkopfes; bei Hochdruck-LC-Systemen umfasst dies den Mischer, die Verbindungsleitungen und die Autosampler-Schleife als Hauptkomponenten; wenn Komponenten der mobilen Phase online isokratisch gemischt werden.
22. Detektor – Ein Gerät, das eine Änderung der Zusammensetzung des Eluenten durch Messung physikalischer oder chemischer Eigenschaften anzeigt (z. B. Absorption im UV-/sichtbaren Licht, unterschiedlicher Brechungsindex, Fluoreszenz oder Leitfähigkeit). Einige Detektoren (z. B. elektrochemisch, massenspektrometrisch) wirken zerstörend; d. h. sie bewirken eine chemische Änderung der Probenkomponenten. Wenn ein Detektor die Probe zerstört, wird ein Splitter zur Umleitung eingesetzt.
23. Chromatographie – Eine dynamische physikalisch-chemische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten auf zwei Phasen verteilt werden, von denen eine stationär ist (die stationäre Phase), während sich die andere (die mobile Phase) relativ zur stationären Phase bewegt.
24. Chromophor – Teil eines Moleküls, der bestimmte Wellenlängen des sichtbaren Lichts absorbiert und andere durchlässt oder reflektiert. Das Chromophor ist eine Region im Molekül, in der die Energiedifferenz zwischen zwei verschiedenen Molekülorbitalen in den Bereich des sichtbaren Spektrums fällt. Sichtbares Licht, das auf den Chromophor trifft, kann also absorbiert werden, indem ein Elektron aus seinem Grundzustand in einen angeregten Zustand versetzt wird.

LITERATURHINWEISE

• Die präparative Chromatographie hat sich zu einer unschätzbaren Technik für die pharmazeutische Herstellung, Trennung von Naturstoffen und andere wichtige Vorgänge, bei denen die Erzeugung von aufgereinigtem Material erforderlich ist, entwickelt. Der Schlüssel zur optimalen Nutzung der Technik liegt in direktem Verhältnis zur Qualität der Methodenentwicklung. Sobald ein Aufreinigungssystem mit der entsprechenden Hardware und Software für eine Aufreinigung im großen Maßstab ausgestattet ist, wird der Methodentransfer vom kleinen auf den großen Maßstab zur Routine. 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., „Natural Products Isolation“ Second Edition. Humana Press. 2006.
  • Aubin, A. „UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis“, Waters Corporation, Milford, MA USA. 2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., „Practical Chemistry Considerations for Purification“. Waters Presentation. 2008.
  • Dolan, J. „A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection“. Advanced Chromatography Technologies.www.ace-HPLC.com
  • Jablonski, J et.al. „Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation“. Waters Corporation, Milford, MA, USA
  • „At-Column-Dilution, Application Notes“, Waters Corp, 2003.
  • Für weitere Informationen über nützliche Applikationshinweise und Referenzen besuchen Sie bitte www.waters.com und geben Sie die blauen Referenznummern oben in das Suchfeld ein.