Präparative Flüssigchromatographie – Leitfaden

Wenn eine isokratische Trennung oder ein fokussierter Gradient die interessierende Verbindung nicht adäquat auflösen kann, kann die Trennung durch Änderungen des Lösungsmittels, des pH-Werts, der stationären Phase und/oder der Temperatur neu entwickelt werden. Diese Arten von Modifikationen können einen dramatischen Einfluss auf die Trennung haben, daher muss ein Scouting von Gradienten gefolgt von einer Methodenoptimierung durchgeführt werden, nachdem eine dieser Änderungen vorgenommen wurde.

Lösungsmittel

Die mobile Phase der HPLC besteht aus drei Komponenten; schwaches Lösungsmittel, starkes Lösungsmittel und Modifikator. Lösungsmittel müssen von hoher Reinheit, mit dem Detektor kompatibel, mit der Probe nicht reaktiv und niedrigviskos sein, um den Systemrückdruck niedrig zu halten.

Bei der Umkehrphasenchromatographie ist das schwache Lösungsmittel fast immer Wasser, während Acetonitril und/oder Methanol aufgrund der niedrigen Viskosität, der hohen Stärke und der UV-Begünstigung im niedrigen Wellenlängenbereich üblicherweise als starkes Lösungsmittel verwendet werden. Acetonitril und Methanol haben auch die beste Peakform, sind nach der Trennung leicht zu verdampfen und neigen dazu, mit den meisten Proben nicht zu reagieren.

Wie bei jedem Lösungsmittel, das für die chromatographische Trennung verwendet wird, ist es wichtig, während der Probenanalyse über dem UV-Grenzwert des Lösungsmittels zu bleiben. Unterhalb dieses Werts werden Änderungen der Lösungsmittelzusammensetzung vom Detektor als Basisliniendrift oder andere chromatographische Störungen aufgezeichnet.

Trennung und Peakordnung können je nach dem für die Trennung verwendeten starken Lösungsmittel unterschiedlich sein. Das Lösungsmittel, das die höchste Auflösung für die interessierende Verbindung bietet, lässt sich nur schwer vorhersagen. Daher wird die Wahl des starken Lösungsmittels oft durch "Trial and Error" (Ausprobieren) bestimmt. Optional können starke Lösungsmittel (z. B. 50:50 Acetonitril/Methanol) gemischt werden, um eine gewünschte Elutionsreihenfolge oder Auflösung zu erreichen.

pH-Wert

Der pH-Wert der mobilen Phase ist eine sehr wichtige Variable bei der Steuerung der Retention bei Umkehrphasentrennungen. Verbindungen enthalten oft eine oder mehrere saure oder basische funktionelle Gruppen, weshalb für die meisten mobilen Umkehrphasen eine pH-Steuerung erforderlich ist.

Wenn eine Säure mehr als 2 pH-Einheiten über oder unter ihrem pK_a-Wert liegt, wird sie zu > 99 % ionisiert bzw. nicht ionisiert. Im Gegensatz dazu werden Basen unterhalb ihres pK_{a-Wertes ionisiert und oberhalb ihres pKa}-Wertes nicht ionisiert. Die nicht ionisierte Form ist weniger polar (hydrophober) und wird daher in einem Umkehrphasensystem stärker reteniert. Daher werden Säuren bei niedrigen pH-Werten besser reteniert, während Basen bei hohen pH-Werten besser reteniert werden.

Wenn der pH-Wert der mobilen Phase in der Nähe des pK_a der interessierenden Verbindung liegt, können kleine Änderungen des pH-Werts große Änderungen der Retention bewirken, was sich direkt auf die Robustheit der Trennung auswirken kann. Der pH-Wert der mobilen Phase wird durch die Zugabe eines Puffers kontrolliert. Der Puffer hält den pH-Wert aufrecht, wenn eine kleine Menge Säure oder Base hinzugefügt wird. Es ist am effektivsten, wenn er innerhalb von ±1 pH-Einheiten vom pK_a verwendet wird. Er kann aber eine ausreichende Pufferung mit ±2 pH-Einheiten vom pK_a bieten.

Bei der Auswahl eines Arbeits-pH-Werts sollte auch die Stabilität der Säule berücksichtigt werden.

Säulen auf Silikabasis werden am besten zwischen pH 2 und pH 8 betrieben. Eine gebundene Phase ist bei niedrigen pH-Werten anfällig für Hydrolyse und bei hohen pH-Werten wird das Silika-Backbone zunehmend löslich. Bei pH-Werten über 8 ist ein Partikel, der nicht auf Silika basiert, oder ein Partikel mit einem speziell für hohe pH-Stabilität hergestellten Liganden erforderlich. pH-Grenzwerte und allgemeine Empfehlungen zur Handhabung finden sich in der Packungsbeilage der Säule oder auf der Website des Säulenherstellers.

Wenn zur Aufreinigung ein chromatographisches Verfahren eingesetzt werden soll, müssen die zur Einstellung des pH-Werts verwendeten Pufferzusätze ausreichend flüchtig sein, um die Entfernung aus dem aufgereinigten Isolat zu erleichtern. Außerdem muss bei Verwendung flüchtiger Additive darauf geachtet werden, dass eine Kontamination oder Ausfällung in der MS-Quelle vermieden wird. Gebräuchliche Additive wie Ameisensäure, Essigsäure und Ammoniumacetat funktionieren am besten bei einer Konzentration von 0,05 bis 0,1 %, wenn sie in der mobilen Phase gelöst werden. Phosphat, der beliebteste Pufferzusatz für Flüssigchromatographie-Trennungen, wird für Aufreinigungs- oder MS-Applikationen nicht empfohlen.

Empfohlen werden Pufferkonzentrationen zwischen 5 und 10 mM. Bei Verwendung von Puffern ist es wichtig, den Puffer nach der Vorbereitung zu filtrieren und die Pumpenleitungen bei Nichtgebrauch zu spülen, um Ausfällungen in der Pumpe und den Leitungen zu vermeiden und die Lösungen regelmäßig zu ersetzen, um eine Ansammlung von biologischem Wachstum zu verhindern.

Stationäre Phase

Die stationäre Phase der Säule hat einen erheblichen Einfluss auf die Trennung. Stationäre Phasen für Umkehrphasen liegen im Bereich von C_{18 bis C8} oder können entwickelte Liganden enthalten, um die Selektivität und Trennleistung zu erhöhen. Viele Labore haben nur einen begrenzten Bestand an Säulen. Daher ist der Austausch der stationären Phase oft die letzte Möglichkeit, wenn Lösungsmittel und pH-Wert keine ausreichende Auflösung bieten. Die Waters Reversed-Phase Column Selectivity Chart (www.waters.com) bietet einen Vergleich der Selektivitäten zwischen verschiedenen Herstellern stationärer Phasen. Dieses Tool ist in der frühen Methodenentwicklung sehr nützlich, um die Säulenselektivität zu vergleichen.

Länge

Die Säulenlänge ist ein Faktor für die Trennleistung. Die Säulen sind in verschiedenen Längen erhältlich, darunter 25 mm, 50 mm, 100 mm, 150 mm und 250 mm.

Kürzere Säulen haben niedrigere Bodenzahlen, eignen sich aber für schnelle Trennungen, während längere Säulen höhere Bodenzahlen aufweisen und zu längeren Retentionszeiten führen. Je größer die Länge, desto größer der Rückdruck, die Laufzeit, der Lösungsmittelverbrauch und die Kosten. Daher ist die kürzeste Säule, die eine ausreichende Auflösung bietet, die ideale Option.

Partikelgröße

Die Fähigkeit der Säule, der Dispersion oder Ausbreitung einer Probenbande beim Durchgang durch die gepackte Säule zu widerstehen, wird als „Effizienz“ bezeichnet. Kleinere Partikelgrößen erhöhen die Effizienz, da die Peakdispersion innerhalb der Partikel geringer ist. Der hohe Wirkungsgrad führt zu schmalen Peakbreiten und einer besseren Trennleistung.

Die Partikelgrößen der präparativen Säule liegen in der Regel im Bereich von 5 ist 10 µm, während für analytische Trennungen im Ultrahochdruckbereich Partikelgrößen von 1,7 bis 3,5 µm verwendet werden. Auch wenn sehr kleine Partikel für eine höhere Effizienz sorgen, so sind dafür jedoch höhere Säulenkosten und ein höherer Systemrückdruck zu beachten. Präparative Säulen im großen Maßstab, die bei hohen Flussraten mit nicht vorgereinigten Probenmischungen betrieben werden, werden aus diesen Gründen häufig nicht für sehr kleine Partikelgrößen angeboten.

Temperatur

Da unterschiedliche Temperaturen die Selektivität beeinflussen können, ist das Beheizen der Säule praktisch, um die Trennung einer bestimmten Probe zu optimieren. Die Viskosität der mobilen Phase und der Gesamtdruck des Systems sinken mit steigender Temperatur, was zu einer geringeren Belastung des Systems, der Fittings und der Säule führt, was letztendlich den Betrieb robuster macht. Die Temperatur kann auch die Retentionszeiten verkürzen und die Selektivität der Trennung verändern. Es ist schwer vorherzusagen, ob Temperaturänderungen die Peakauflösung erhöhen oder verringern, daher ist der Nutzen für jede spezielle Trennung spezifisch.

Während die Temperaturkontrolle in der Chromatographie in kleinem Maßstab Routine ist, wird die Temperatur nur selten als Parameter zur Beeinflussung der Chromatographie eingesetzt, die für die Aufreinigung im präparativen Maßstab vorgesehen ist. Zunächst kann es schwierig sein, Säulen mit großem Durchmesser gleichmäßig von außen zu beheizen. Zweitens neigen Trennungen mit hohen Flussraten, die im großen Maßstab eingesetzt werden, dazu, bei der Temperatur des einströmenden Lösungsmittels zu bleiben. Elektrische Decken und Säulenöfen sind zwar für Trennungen im kleinen Maßstab zufriedenstellend, können aber eine große Säule nicht gleichmäßig über den Durchmesser der Säule beheizen. Als Folge bilden sich Temperaturgradienten über den Durchmesser der Säule, die die Chromatographie nachteilig beeinflussen.

Wenn zur Aufrechterhaltung der Probenlöslichkeit eine Temperaturregelung erforderlich ist, können Temperaturgradienten überwunden werden, indem die präparative Säule in ein beheiztes Wasserbad gegeben wird und am Säulenkopf eine Kapillare angeschlossen wird. Das Länge der Kapillare fungiert als Vorheizer, um das einfließende Lösungsmittel auf die gewünschte Temperatur zu bringen. Chromatographie, die für zukünftiges Scale-up gedacht ist, wird am besten unter Umgebungsbedingungen entwickelt und die Temperatursteuerung als letztes Mittel verwendet.