Präparative Flüssigchromatographie – Leitfaden

Nachdem eine Trennmethode entwickelt und auf den gewünschten Maßstab skaliert wurde, besteht der letzte Schritt darin, die interessierende Verbindung zu isolieren oder zu sammeln. Fraktionen können während der Überwachung der Peakelution vom Anwender manuell gesammelt werden. Alternativ kann die Fraktionssammlung auch auf Basis des Detektorsignals oder der Retentionszeit automatisiert werden.

Fraktionsverzögerungszeit

Die Fraktionssammlung findet statt, wenn der Detektor einen Peak erkennt, der die vom Anwender definierten Kriterien für den Trigger zum Sammlung erfüllt. Wenn der Peak im Detektor vorhanden ist, ist er noch nicht zum Fraktionssammler gelangt. Wenn der Trigger das Sammeln zu früh auslöst, würde der Peak vom Fraktionssammler übersehen werden. Eine systemspezifische Fraktionsverzögerungszeit muss im Voraus bestimmt werden, um das Sammeln der Fraktionen zeitlich korrekt durchzuführen. Eine Methode der Kalibrierung beinhaltet die Injektion eines konzentrierten Farbstoffs und den Vergleich der Zeit, die benötigt wird, um vom Detektor gesehen zu werden, mit der Zeit, die es dauert, den Fraktionssammler zu erreichen. Die Kalibrierung der Fraktionsverzögerungszeit ist normalerweise ein einmaliger Vorgang und kann, sobald sie in die Software eingegeben wurde, für jede Flussrate neu berechnet werden. Die Fraktionsverzögerungszeit muss neu kalibriert werden, wenn Änderungen am Flussweg vom Detektor zum Fraktionssammler vorgenommen werden, z. B. wenn ein Flusssplitter hinzugefügt wird.

Manuelle Fraktionssammlung

Die manuelle Sammlung ist recht unkompliziert und einfach. Der Anwender löst das Umschalten des Schaltventils am Fraktionssammler aus, während die Elution der Verbindung über eine online-basierte Echtzeit-Signaldarstellung der Gerätesoftware überwacht wird. Die manuelle Fraktionssammlung bietet die höchste Flexibilität, da nur die gewünschten Teile des Aufreinigungslaufs gesammelt werden, der Durchsatz jedoch aufgrund der fehlenden Automatisierung dazu neigt, niedrig zu sein.

Peakbasierte Fraktionssammlung

Die Peak-basierte Triggerung ist eine automatisierte Methode zum Sammeln von Fraktionen auf Basis eines Detektorsignals. Parameter, die verwendet werden, um zu entscheiden, ob ein Peak im Chromatogramm den Fraktionssammler auslösen soll, sind in der Regel Peakhöhe, Schwellenwert und/oder Steigung.

Der gebräuchlichste Ansatz für die peakbasierte Fraktionssammlung basiert auf der Höhe oder dem Schwellenwert. Sobald ein Signal eine vordefinierte Detektorhöhe erreicht, wird die Fraktionssammlung ausgelöst. Wenn das Signal eine vordefinierte Höhe unterschreitet, wird die Sammlung angehalten.

Das Sammeln von Fraktionen durch Steigung ist oft eine schwierigere Sammelmethode, aber sie kann verwendet werden, um Peaks zu sammeln, die nicht von der Basislinie getrennt sind. Beim Sammeln nach Steigung wird die Fraktionssammlung automatisch von der Software an mathematischen Wendepunkten ausgelöst, die entlang der ersten Ableitung des Chromatogramms erkannt werden.

Fraktionssammlung durch Massendetektion

Bei der massenbasierten Fraktionssammlung werden nur die Verbindungen mit der benutzerdefinierten gewünschten Masse gesammelt. Daher kann die Sammlung nach Masse effizienter sein als die Sammlung auf Basis von Peaks. Die Anforderungen für die massenbasierte Fraktionssammlung werden wie folgt zusammengefasst:

• Die Molekülmasse der Verbindung muss bekannt sein.
• Für die Massendetektion muss die Verbindung ionisiert werden.

Fraktionsanalyse

Sobald die Fraktionen gesammelt wurden, können sie direkt im Sammelgefäß analysiert werden oder das Lösungsmittel kann entfernt werden, um das aufgereinigte Produkt zu erhalten. Ein Rotationsverdampfer kann verwendet werden, um die Fraktion zur Trockne zu bringen. Mit diesem Tool wird das Lösungsmittel aus der Probe verdampft und der wässrige Teil wird gefriergetrocknet. Wenn anorganische Puffer verwendet wurden oder der wässrige Anteil besonders groß ist, kann die Fraktion durch eine Umkehrphasen-SPE-Kartusche geleitet werden, um die Zielverbindungen (d. h als Entsalzung bekannt) einzuschließen. Die eingeschlossenen Verbindungen werden dann mit einer kleinen Menge eines organischen Lösungsmittels eluiert, das leichter verdampft werden kann.

Eine Schätzung der Wiederfindung kann durch Fraktionsanalyse unter Verwendung verschiedener routinemäßiger Analysetechniken bestimmt werden, wie z. B. UV, IR, MS, NMR, Röntgen, Assay und/oder Strukturaufklärung. Wenn ein Standard verfügbar ist, ist es einfach, einen direkten Vergleich des Isolats mit Literaturdaten vorzunehmen. Wenn die Zielverbindung jedoch unbekannt ist, ist ein breiter, umfassender systematischer Ansatz erforderlich, der eine Vielzahl physikalischer, chemischer und spektroskopischer Techniken umfasst, um ein Reinheits- und Stabilitätsprofil zu erstellen.

Gleichung 14: % Wiederfindung

Wenn bei der Analyse des Isolats Reinheit, Wiederfindung oder Aktivität nicht den Erwartungen entsprechen, untersuchen Sie das Isolat auf die folgenden Situationen:

• Bei Tests direkt aus dem Sammelgefäß können sich Konzentrationsgradienten bilden. Daher hängt das Reinheitsergebnis davon ab, woher die Probe im Sammelgefäß kommt. Die Proben sollten vor der Analyse gut gemischt werden, um ein repräsentatives Ergebnis zu erhalten.
• Wenn die Probe am besten in einem starken Lösungsmittel wie DMSO löslich ist, aber nicht in der mobilen Phase, wird die gesammelte Fraktion kristallisieren, wenn sie im Laufe der Zeit im Sammelgefäß gelagert wird. Wenn die flüssige Phase zur Reinheits- und Konzentrationsanalyse entnommen wird, sind die Ergebnisse nur für den löslichen Teil repräsentativ.
• Der Wirkstoff kann auch aufgrund von Zersetzung zwischen dem Zeitpunkt der Sammlung, dem Reinheitstest und dem Aktivitätstest verloren gehen. Er kann sich auch während des Trocknens zersetzen. Daher werden Aktivitätstests fast immer vor und nach dem Trocknen durchgeführt.
• Der Wirkstoff wurde auf der Säule reteniert.
• Der Wirkstoff ist unter den bei der Trennung verwendeten Bedingungen instabil.
• Die Extraktlösung wurde möglicherweise nicht in einem Lösungsmittel hergestellt, das mit der mobilen Phase kompatibel ist, sodass Ausfällungen aufgetreten sein können.
• Der Großteil des Wirkstoffs ist über einen weiten Bereich von Fraktionen verteilt, wodurch nicht nachweisbare Mengen der Verbindung in den Fraktionen vorhanden sind.
• Die Aktivität des Extrakts könnte auf das Vorhandensein anderer Verbindungen in der nicht vorgereinigten Probe zurückzuführen sein und nicht einzeln aktiv sein.
• Das Isolat ist möglicherweise nicht so rein wie erwartet, wenn das Isolat bei einer UV-Wellenlänge gesammelt wurde, bei der eng eluierte Verunreinigungen nicht absorbiert wurden.

Wenn das Isolat die Anforderungen der Applikation hinsichtlich Reinheit, Durchsatz oder Wiederfindung nicht erfüllt, kann eine erneute Aufreinigung des Isolats entweder mit derselben Trennmethode durchgeführt werden oder es kann eine neue Trennmethode mit anderer Säulenselektivität entwickelt werden. Es liegt am Anwender, den Zeit- und Arbeitsaufwand für die Aufreinigung zu bestimmen, um die gewünschten Reinheits-, Durchsatz- und Wiederfindungsziele zu erreichen.