Präparative Flüssigchromatographie – Leitfaden

Chromatographie ist die Trennung eines Gemisches auf der Grundlage der chemischen Eigenschaften der Komponenten in diesem Gemisch. Die präparative (Prep) oder Aufreinigungschromatographie ist der Prozess der Verwendung von Chromatographie zur Trennung einer Verbindung in einer Menge und in einem Reinheitsgrad, die für weitere Experimente oder Prozesse ausreichen. Ein Wissenschaftler bestimmt eine interessierende Verbindung und entwickelt dann eine Methode, um diese Verbindung erfolgreich von Ausgangsmaterialien, Nebenreaktionen oder anderen Verunreinigungen zu trennen. Das übergeordnete Ziel ist es, die steigenden Anforderungen an hohen Durchsatz und Produktivität zu erfüllen und gleichzeitig die Aufreinigungstechniken anzupassen, um entsprechende Anforderungen an Maßstab, Reinheit und Reproduzierbarkeit zu erfüllen.

Die Aufreinigungschromatographie wird in vielen wissenschaftlichen Einrichtungen eingesetzt, von großen Pharmaunternehmen bis hin zu kleinen Forschungsgruppen für Naturstoffe. Obwohl die Applikationsbereiche unterschiedlich sein können, sind die allgemeinen Anforderungen der Anwender ziemlich ähnlich, mit einem gewünschten Endreinheitsgrad von 95 % oder mehr für die Zieltrennung.

Ziel dieser Einführung ist es, Anwendern der Flüssigchromatographie einführende Informationen in Bezug auf das schnell wachsende Gebiet der LC-Aufreinigung zu liefern. Es werden grundlegende Prinzipien wie die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode, mathematische Gleichungen für das Scale-up der Methode und häufig verwendete Modi für die Fraktionssammlung vorgestellt. Die Umkehrphase ist das primäre besprochene Trennverfahren, da es in den meisten präparativen LC-Applikationen verwendet wird.

Der Erfolg einer Trennung durch Aufreinigung wird durch den Durchsatz, die Wiederfindung und die Reinheit des erhaltenen Isolats bestimmt. Die Trennung wird durch die Peaktrennung oder „Auflösung“ durchgeführt. Die folgenden chromatographischen Parameter haben den größten Einfluss auf die Auflösung:

• Säulenpackungsmaterial (stationäre Phase)
• Lösungsmittelstärke

Bedingungen, die für eine optimale Auflösung sorgen, werden durch Ausführen eines Workflows zur Methodenentwicklung bestimmt. Der Workflow ist recht einfach, besteht jedoch aus mehreren Schritten, deren Komplexität und Notwendigkeit auf den einzigartigen Eigenschaften jeder Probe beruhen. Unabhängig von der Applikation oder dem Modus der Probentrennung (d. h. Umkehrphasen, Ionenaustausch usw.) ist der Workflow im Allgemeinen gleich.

Der wichtigste Faktor, der vor der Erstellung eines Workflows berücksichtigt werden muss, ist die Art der Zielverbindung. Wenn eine bekannte Verbindung aus einer bekannten oder unbekannten Quelle getrennt wird, ist es einfach, Literaturinformationen über das chromatographische Verhalten der Zielverbindung zu erhalten, und die geeignete Methode zur Trennung kann ohne Schwierigkeiten aus bereits veröffentlichten Methoden ausgewählt werden. Es ist jedoch schwieriger, ein Protokoll für die Trennung eines Rohextrakts zu erstellen, bei dem die Verbindungstypen unbekannt sind. In diesem Fall kann nach der anfänglichen Trennung eine Reihe von explorativen Experimenten durchgeführt werden, um mehr über die interessierende Verbindung wie pK_a, Molekulargewicht, Löslichkeit, Stabilität, UV-Spektren und biologische Aktivität zu erfahren. Anhand dieser Informationen kann die Trennmethode modifiziert werden, um den chemischen und physikalischen Anforderungen der Verbindung gerecht zu werden. Diese Informationen sind nicht nur bei der Methodenentwicklung hilfreich, sondern auch nach der Sammlung, wenn die Stabilität des isolierten Produkts wichtig ist.

Der erste Schritt besteht darin, eine Probe vorzubereiten und eine allgemeine Trennung mithilfe eines schnellen Scouting-Gradienten durchzuführen. Dies wird normalerweise in kleinem Maßstab durchgeführt, um wertvolles Probenmaterial zu erhalten. Aus dieser Trennung kann die Bedingung für das Lösungsmittel berechnet werden, die die interessierende Verbindung eluiert, wodurch die Bedingungen für die Trennung weiter optimiert werden können, um die Auflösung zu maximieren. Es kann auch eine Beladungsstudie durchgeführt werden, um festzustellen, wie viel Probe geladen werden kann, ohne dass die Auflösung für die Herstellung eines hochreinen Isolats beeinträchtigt wird.

Nachdem die Trennmethode und die gewünschte Probenbeladung festgelegt wurden, wird häufig, wenn auch nicht immer, für Isolate mit erfolgversprechendem oder potenziellem Wert ein Methoden-Scale-up durchgeführt. Der Begriff „Maßstab“ in diesem Leitfaden soll die Geräteausstattung und Methodik beschreiben, die erforderlich sind, um die Ziele der Applikation hinsichtlich Reinheit, Durchsatz und Ausbeute zu erreichen. Wenn eine Methode „hochskaliert“ wird, wird sie für ein System ausgelegt, dessen Hardware für höhere Probenbeladungen geeignet ist. Das Scale-up umfasst im Wesentlichen den Wechsel von einer analytischen zu einer präparativen Säule, während die Auflösung durch eine Reihe von Scale-up-Berechnungen und Hardwareänderungen beibehalten wird.

Proben

Proben, aus denen eine bestimmte Verbindung isoliert werden kann, stammen aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Arzneimittelzwischenprodukten, Naturstoffen, Nutrazeutika, Getränken oder Industrieprodukten. Solange ein Material extrahiert und in einer flüssigen Matrix gelöst werden kann, können die einzelnen Komponenten durch Chromatographie aufgereinigt werden.

Die zur Probenextraktion verwendeten Techniken hängen von der Komplexität des Materials ab, aus dem extrahiert wird. Bei Naturstoffen wird die Probe in der Regel getrocknet und zu feinen Partikeln gemahlen, um die Effizienz der Extraktion zu erhöhen. Dann kann eine Technik wie Perkolation für große Probengrößen oder Mazeration für kleine Probengrößen verwendet werden, um die interessierenden Verbindungen zu extrahieren. Beide Techniken beinhalten die Zugabe eines Lösungsmittels zum Probenmaterial und das Sammeln des gelösten Stoffes nach der Ultraschallbehandlung, dem Schwenken oder dem Einweichen. Nachdem der Extrakt gesammelt wurde, muss er, wie bei allen HPLC-Proben, vor der Injektion filtriert werden, um Partikel zu entfernen und frei von Blasen zu sein.

Trennungsarten

In der präparativen Chromatographie werden hauptsächlich vier Trennmethoden verwendet. Diese umfassen Umkehrphasen, Normalphasen, Gelpermeation und Ionenaustauscher. Der geeignete Trennmodus wird durch die Kompatibilität der stationären Phase und der Lösungsmittel mit der zu analysierenden Probe, dem Extrakt oder dem Gemisch bestimmt.

Die Umkehrphasentrennung, die die gebräuchlichste Technik für die Aufreinigungsentwicklung ist, verwendet eine stationäre Phase, die weniger polar ist als das eluierende Lösungsmittel. Der Eluent ist ein Gemisch aus Wasser und Acetonitril oder Methanol, während Puffer (Säuren oder Basen) hinzugefügt werden, um den Grad der Ionisierung der Probe zu kontrollieren und freie, nicht reagierte Silanolgruppen in der stationären Phase zu besetzen. Die gebundenen Phasenmaterialien oder Sorbenzien in stationären Phasen auf Silikabasis werden mit Alkylsilylreagenzien derivatisiert, um Peak-Tailing zu reduzieren und die chromatographische Reproduzierbarkeit zu verbessern. Der Grad der Kohlenstoffbeladung mit diesen derivatisierten Reagenzien (Silanisierung) kann Säulen verschiedener Hersteller einzigartige Trenneigenschaften verleihen.

Methodenentwicklung – Kurzeinführung

Um eine Umkehrphasentrennung durchzuführen, wird häufig eine kleine analytische Trennsäule (≤ 4,6 mm Durchmesser) mit einer Länge und einem Packungsmaterial ausgewählt, die in einem großen Maßstab (10 mm Durchmesser) verfügbar ist, um ein zukünftiges Scale-up zu erleichtern. Das richtige Lösungsmittelsystem für eine optimale Trennung ist entscheidend. Für saure Verbindungen wird im Allgemeinen eine wässrige mobile Phase mit einem sauren pH-Wert hergestellt, während entweder Methanol oder Acetonitril als starkes Lösungsmittel hergestellt wird. Ameisensäure, mit einer Konzentration von 0,1 %, ist ein häufig verwendetes Pufferadditiv, da es sowohl mit UV als auch mit Massenspektrometrie kompatibel ist. Die MS-Kompatibilität ist bei der Identifizierung unbekannter Verbindungen und der Vorbereitung eines aufgereinigten Isolats für weitere Untersuchungen hilfreich. Anstelle eines sauren pH-Werts kann eine mobile Phase mit basischem pH verwendet werden, um die nichtionisierte Form der basischen Moleküle beizubehalten. Vor der Verwendung eines Puffers bei einem beliebigen pH-Wert sollte das beiliegende Dokument der stationären Phase zur Kompatibilität herangezogen werden.

Die wässrige mobile Phase befindet sich in der Regel in Pumpenposition A und das starke Lösungsmittel in Pumpenposition B. „A“ und „B“ werden in dieser Einführung für wässrige bzw. starke Lösungsmittel in den Pumpentabellen verwendet.