Guia para iniciantes em cromatografia de convergência

Este capítulo analisa, primeiro, a terminologia utilizada na CC. Em seguida, ele descreve que tipos de amostras e analitos são candidatos para análise pelo Sistema ACQUITY UPC². Descrevemos a função de cossolventes, aditivos de fase móvel e diluentes de amostra, bem como os efeitos da pressão e da temperatura na densidade e como isso afeta as separações. Por fim, apresentamos um protocolo genérico para o desenvolvimento de um método.

Terminologia

Conforme descrito anteriormente, a CC é semelhante à RPLC (Cromatografia líquida de fase reversa, Reversed Phase Liquid Chromatography), mas substitui o CO₂ comprimido como solvente fraco (fase móvel A) em vez de água. Todos os termos convencionais, como solvente, cossolvente ou modificador, referem-se a componente(s) líquido(s) primário(s) da fase móvel B, o solvente de eluição forte. Normalmente, na CC, o cossolvente é o metanol, mas também é possível utilizar outros solventes orgânicos, como etanol, álcool isopropílico, acetonitrila ou combinações desses. Um aditivo é um sal ou líquido adicionado ao cossolvente em uma concentração baixa para melhorar o formato de pico e/ou a solubilidade do analito. O aditivo também pode influenciar a seletividade cromatográfica. Os aditivos típicos incluem dietilamina, hidróxido de amônio, ácido fórmico, ácido trifluoroacético, formiato de amônio, acetato de amônio ou pequenas quantidades de água. A concentração apropriada depende do aditivo. Por exemplo: a adição de água acima de 5% poderá levar à formação de uma fase móvel bifásica se as demais condições do método não forem escolhidas adequadamente.

Uma das primeiras perguntas feitas sobre qualquer nova metodologia analítica é: “Minha amostra pode ser analisada por essa técnica (cromatografia de convergência)?” A resposta mais simples é: se for possível dissolver a amostra em um solvente orgânico, ela será candidata à CC. Não existe uma resposta universal para essa pergunta e algum trabalho experimental será necessário para respondê-la com certeza. A compatibilidade com solventes de injeção orgânicos é muito conveniente, pois muitas técnicas de preparo de amostras produzem amostras em solvente orgânico (por exemplo, extração de líquido/líquido, extração em fase sólida, precipitação de proteína). A beleza da CC é que as amostras, em um solvente orgânico, podem ser injetadas diretamente no Sistema ACQUITY UPC², bem como não exigem as etapas trabalhosas e demoradas de evaporação ou reconstituição, muitas vezes exigidas na RPLC. O Capítulo 5 aborda esse assunto mais detalhadamente. Para o cientista analítico, é sempre útil aprender o máximo possível sobre uma amostra (Figura 23) — quanto mais você souber, mais chances você terá de desenvolver um método robusto. Uma informação útil acerca da solubilidade de compostos em vários solventes orgânicos está relacionada ao coeficiente de partição (P) (normalmente chamado de log₁₀ P). O coeficiente de partição (P) é a razão das concentrações de um composto nas duas fases de uma mistura de dois solventes imiscíveis em equilíbrio, normalmente água e 1-octanol (Figura 24). Esses coeficientes são uma medida da solubilidade diferencial do composto entre esses dois solventes. O coeficiente de partição mede o quão hidrofílico ou hidrofóbico é um composto.

Em termos de CC, o coeficiente de partição pode ajudar a determinar se um composto-alvo é um candidato para análise pelo Sistema ACQUITY UPC². Como regra geral, os compostos com valores de log P entre 2 e 9 são candidatos adequados para CC.

Cossolventes em cromatografia de convergência

O cossolvente desempenha duas funções. Primeiro, ele influencia o poder de solvência do CO₂. Em segundo lugar, ele influencia a interação entre o analito e a fase estacionária. Alterar o cossolvente (por exemplo, de metanol para acetonitrila) afeta tanto a retenção quanto a seletividade. A função do cossolvente na CC é análoga à do solvente forte na LC de fase reversa: o CO₂ sozinho tem aproximadamente a força de eluição do heptano.

A Tabela 1, no Capítulo 1, mostra a série eluotrópica (força de eluição) para uma variedade de solventes orgânicos e destaca os quatro cossolventes mais comuns utilizados na CC: acetonitrila, álcool isopropílico, etanol e metanol. Os solventes listados são todos miscíveis com CO₂, resultando em uma ampla variedade de forças de retenção e eluição disponíveis.

Em geral, cossolventes adicionados à fase móvel de CO₂ diminuem o tempo de retenção de um analito. Quando a concentração de cossolvente aumenta, a polaridade da fase móvel muda, diminuindo o(s) tempo(s) de retenção. A Figura 25 ilustra o efeito da alteração da concentração de cossolvente na retenção em uma separação isocrática. À medida que a concentração do cossolvente de eluição forte (metanol) diminui, a retenção dos analitos aumenta. Esse é o mesmo fenômeno observado na RPLC.

A Figura 26 demonstra como a força da fase móvel muda com diferentes cossolventes. O metanol é o cossolvente mais forte e elui os analitos mais rapidamente. O álcool isopropílico é mais fraco do que o metanol, mas mais forte do que a acetonitrila. Já a acetonitrila é o mais fraco dos três cossolventes na CC e retém os analitos por mais tempo. O mesmo tipo relativo de comportamento cromatográfico ocorre em outros modos de cromatografia: solventes mais fortes diminuem a retenção e eluem os analitos mais rapidamente.

É possível misturar diferentes cossolventes na CC, o que altera a força deles e resulta em diferenças na retenção. A Figura 27 ilustra o efeito da adição de um cossolvente mais fraco (acetonitrila) ao metanol para uma separação de gradiente de metoclopramida e impurezas relacionadas. Conforme a concentração de acetonitrila aumenta, a concentração de metanol e, portanto, a força do solvente diminuem, o que resulta em tempos de retenção mais longos. Pequenas alterações na seletividade, resolução aprimorada e picos mais finos com um cossolvente diferente para essa separação.

Aditivos em cromatografia de convergência

Como na RPLC, os aditivos na CC melhoram o formato de pico e/ou a resolução da separação. Na Figura 27, são mostrados os efeitos da adição de formiato de amônio a todas as misturas de cossolventes para todos os quatro cromatogramas. Os aditivos podem modificar a superfície da fase estacionária ou agir como pares de íons, alterando a seletividade. Os aditivos básicos tendem a melhorar o formato de pico de compostos básicos e podem alterar um pouco a seletividade. Exemplos de aditivos básicos incluem hidróxido de amônio, 2-propilamina e trietilamina. Os aditivos ácidos podem melhorar o formato de pico de compostos ácidos e alterar a seletividade. Aditivos ácidos comuns incluem ácido trifluoroacético, ácido fórmico e ácido acético. A Figura 28 mostra uma separação de analitos ácidos. Como o exemplo demonstra, aumentar a concentração do aditivo ácido melhora o formato de pico.

Alternar diferentes aditivos pode ter um efeito profundo sobre o formato de pico e a retenção (Figura 29). Para esses analitos básicos (bloqueadores beta), um cossolvente de metanol sem aditivo resulta em um formato de pico inadequado. Na verdade, a adição de ácido fórmico piora o formato de pico. O ácido fórmico também é absorvido no comprimento de onda de detecção de 220 nm, resultando em uma linha de base inclinada. Para essas bases fortes, a adição de acetato de amônio (20 mM), assim como de dietilamina, melhora drasticamente o formato de pico, pois a utilização de aditivos básicos geralmente melhora o formato de pico de compostos básicos.

Diluentes de amostras em cromatografia de convergência

Embora uma ampla variedade de diluentes de amostra seja compatível com a CC, às vezes é necessário selecionar o diluente certo para alcançar o melhor formato de pico. A força do diluente da amostra pode afetar fortemente o formato de pico e a solubilidade na CC. Como em outros modos de cromatografia, recomendamos um diluente de amostra fraco (o mais fraco possível), equilibrando a solubilidade do analito e o formato de pico. Na CC, isso significa que a amostra deve ser dissolvida em um solvente orgânico perto do topo da série eluotrópica (Tabela 1). A Waters recomenda heptano/2-propanol (90:10) como um bom solvente genérico, que equilibra a solubilidade (álcool isopropílico) e o formato de pico (heptano). O teor de água na amostra deve ser reduzido ou eliminado, se possível. A Figura 30 mostra sete cromatogramas sobrepostos de picos do composto neutro butilparabeno. À medida que o volume de injeção aumenta, os efeitos da força do solvente de injeção ficam mais evidentes no formato de pico. No metanol, um cossolvente forte, ocorre uma assimetria frontal do pico conforme o volume de injeção aumenta. O álcool isopropílico mais fraco apresenta uma assimetria frontal menor e picos um pouco mais altos em comparação com o metanol. O álcool isopropílico/hexano, o diluente de amostra recomendado, resulta em picos simétricos e finos em todos os volumes de injeção.

Pressão, temperatura e densidade

A configuração do ABPR (Regulador de contrapressão automatizado, Automatic Back Pressure Regulator) afeta o tempo de retenção, alterando a densidade do CO₂ comprimido. À medida que a configuração de pressão do ABPR sobe, a densidade aumenta, enquanto os tempos de retenção diminuem. Apesar de a composição da fase móvel ter o maior efeito sobre a separação, regular a pressão e a densidade da fase móvel pode ajustar um método. A Figura 31 mostra que aumentar a configuração do ABPR (pressão), deixando todos os outros parâmetros inalterados, resulta em tempos de retenção mais curtos.

 Como na RPLC, a temperatura da coluna afeta a seletividade e a retenção em cromatografias de convergência. Além disso, diferentes analitos são afetados em graus diferentes. O aumento da temperatura da coluna eleva a energia das moléculas dos analitos, o que, como em LC ou GC (Cromatografia a gás, Gas Chromatography), deve levar à diminuição da retenção em fases estacionárias. No entanto, na CC, aumentar a temperatura a uma pressão constante também diminui a densidade da fase móvel, o que reduz seu poder de solvatação e, consequentemente, leva ao aumento da retenção. Portanto, na CC, a variação de temperatura tem um efeito contrário. Em geral, conforme a temperatura da coluna aumenta, a densidade da fase móvel diminui, e os tempos de retenção aumentam (Figura 32). Além disso, observe a presença de um pico adicional (pequeno) a 50 °C. Isso resulta de pequenas diferenças de seletividade, pois a temperatura afeta os diferentes analitos de maneiras diversas.

O formato de pico, a retenção e a seletividade são manipulados por meio da variação e da compreensão das funções do cossolvente, do aditivo, do diluente de amostra, da pressão, da temperatura e da fase estacionária. Combinando tudo o que é apresentado neste capítulo, a Tabela 5 mostra como as separações da CC são otimizadas utilizando essas ferramentas. No entanto, observe que, para uma separação específica, a importância de cada parâmetro pode variar. Por exemplo, às vezes a fase estacionária desempenha um papel maior do que a escolha de cossolvente na manipulação da seletividade. Em outras situações, mudar de metanol para metanol/acetonitrila na proporção de 50:50 desempenha um papel maior do que mudar os recheios de coluna.

Protocolo de desenvolvimento de métodos genérico – Abordagem 1

A Figura 33 descreve um protocolo para determinar rapidamente se uma amostra pode ser dissolvida em um solvente de injeção compatível com CC. Se o log P do analito for um valor entre -2 e 9, será possível fazer isso. Se for inferior a -2, o analito é solúvel apenas em um solvente aquoso e, portanto, talvez não seja compatível com CC. Se o valor de log P do analito for desconhecido, ele deverá ser dissolvido em um solvente orgânico adequado antes da injeção. Lembre-se de que a cromatografia de convergência se comporta mais como uma separação de fase normal, em que solventes como o metanol são um solvente muito forte (o oposto da LC de fase reversa, onde é um solvente bastante fraco).

Consequentemente, a amostra precisa ser dissolvida (ou diluída) em um solvente mais fraco, como heptano/álcool isopropílico. É necessário alcançar um equilíbrio entre a solubilidade da amostra e o formato de pico. O efeito do diluente de amostra no formato de pico em CC é discutido anteriormente neste capítulo.

Além de selecionar um diluente de amostra, há outras considerações que precisam ser feitas no desenvolvimento de um método. Por exemplo, quais condições cromatográficas são apropriadas para o analito em questão? A Figura 34 mostra um conjunto genérico recomendado de condições iniciais conhecidas por reter e separar uma ampla variedade de analitos. Como acontece com qualquer modo de cromatografia, essas condições não são adequadas em todos os casos. Por isso, estratégias para melhorar o formato de pico, bem como para alterar a seletividade e a retenção, podem ser empregadas.

Para esses casos, as Figuras 35, 36 e 37 mostram as abordagens sistemáticas para melhorar o formato de pico, mudar a retenção e alterar a seletividade — e elas não são muito diferentes das utilizadas na LC de fase reversa. A Figura 35 fornece um protocolo para melhorar o formato de pico. O ponto de partida é um conjunto recomendado de condições baseadas na natureza dos analitos de interesse: se eles são principalmente básicos ou ácidos. Os compostos ácidos tendem a ter um melhor formato de pico em condições ácidas, e os compostos básicos tendem a exibir um melhor formato de pico em condições básicas. As estratégias para melhorar o formato de pico incluem tentar um aditivo diferente, alterar a concentração do aditivo e alterar o recheio da coluna.

A Figura 36 fornece um protocolo para aumentar a retenção. Como acontece com qualquer forma de cromatografia líquida, a primeira opção é utilizar um cossolvente diferente (mais fraco). O metanol é o cossolvente mais forte utilizado em CC; utilizar um cossolvente mais fraco, como acetonitrila ou outro álcool, aumenta o tempo de retenção na coluna. Achatar ou reduzir a inclinação do gradiente (diminuindo a porcentagem final de cossolvente ou aumentando a duração do gradiente) também pode ser eficaz. Misturar cossolventes e reduzir a concentração de metanol enfraquecerá a força geral do cossolvente, aumentando assim a retenção. A capacidade de manipular a densidade da fase móvel na coluna é uma propriedade exclusiva da SFC (Cromatografia de fluido supercrítico, Supercritical Fluid Chromatography) e da CC. Isso altera a retenção geral, pois uma densidade menor é igual a uma retenção maior. Isso é feito diminuindo a configuração do ABPR e/ou aumentando a temperatura. Por fim, utilizar um recheio de coluna diferente é outra estratégia para aumentar a retenção.

A Figura 37 ilustra um protocolo para alterar a seletividade (ordem de eluição, retenção relativa) da separação. Tentar diferentes cossolventes, como acetonitrila em vez de metanol, é uma abordagem. A mudança de um cossolvente prótico à base de álcool para um cossolvente aprótico não alcoólico, como acetonitrila, tem um efeito muito maior na seletividade do que mudar de metanol para outro álcool. Como a redução na concentração de metanol enfraquece a força geral do cossolvente, isso pode aumentar a retenção e alterar a seletividade. A manipulação da densidade da fase móvel também pode alterar a retenção geral do analito, pois esses efeitos de densidade podem variar em analitos específicos, o que pode ser suficiente para otimizar uma determinada separação. Por fim, se necessário, esse protocolo recomenda um recheio de coluna diferente.

Protocolo de estratégia de desenvolvimento de métodos para família de colunas – Abordagem 2

O protocolo de desenvolvimento de métodos descrito na seção anterior concentra-se nas condições genéricas iniciais e no impacto da variação das propriedades da fase móvel para ajustar uma separação. Nesta seção, são descritas duas outras alternativas: uma para separação quiral e outra para separação aquiral. Ambas as alternativas exigem combinações de uma coluna e de um método que leve estatisticamente à maior taxa de sucesso para um grupo grande de compostos de teste diversos. De modo geral, é utilizada “força bruta” durante a seleção da coluna da CC. No entanto, os protocolos sugeridos nesta seção propõem uma estratégia passo a passo.

Estratégia de desenvolvimento de métodos para separações quirais utilizando Colunas UPC² Trefoil

O protocolo de screening sugerido para compostos quirais é baseado em três recheios quirais das Colunas Waters UPC² Trefoil: AMY1, CEL1 e CEL2. O protocolo de screening demonstrado na Figura 38 recomenda a utilização desse screening, que oferece um caminho ideal com quatro colunas e quatro etapas, e misturas de cossolventes otimizadas para atingir as melhores chances de sucesso.

De acordo com o protocolo, deve-se começar o screening com a AMY1, utilizando uma mistura de etanol:isopropanol:acetonitrila, na proporção de 1:1:1, com 20 mM de acetato de amônio. Se o método não resultar na separação desejada, o próximo método deve adotar uma coluna CEL1 com uma mistura de metanol e isopropanol, na proporção de 1:1, com 0,2% de TFA (Ácido trifluoroacético, Trifluoroacetic Acid) — e assim por diante. As condições detalhadas do método são fornecidas na Figura 38.

Estratégia de desenvolvimento de métodos para separações aquirais utilizando colunas UPC² Torus

O protocolo de screening para uma separação aquiral segue uma abordagem semelhante. Ela pode ser alcançada em, no máximo, três etapas, descritas abaixo.

Etapa 1

Comece com uma etapa de desenvolvimento rápido utilizando uma coluna Torus 2-PIC (3,0 x 100 mm) e as seguintes condições cromatográficas: 1,2 mL/min, de 4% a 50% de MeOH em BPR de 3 min, 30 °C e 2000 psi

Com base nos resultados obtidos, observe se:

1. a) Os requisitos de seletividade e formato de pico foram atendidos. Então, otimize ainda mais o método apenas se necessário.
2. b) Foi alcançada uma boa seletividade, mas é necessário melhorar o formato de pico. Então, execute uma coluna Torus 2-PIC com um aditivo: ácido fórmico para ácidos ou um aditivo básico para bases.
3. c) Se os dados mostrarem que há necessidade de uma seletividade diferente, prossiga para a etapa 2.

Etapa 2

Com base na natureza da amostra, escolha o caminho apropriado descrito no caminho do fluxo em Screening definido. Em seguida, continue descendo o caminho do fluxo utilizando a combinação de coluna e cossolvente sugerida até que uma separação adequada seja alcançada.

Etapa 3

Para ajustar a separação, é possível otimizá-la ajustando a composição do cossolvente do método, a temperatura, o aditivo e a pressão. As figuras na seção 4.7 mostram como otimizar um método dessa maneira.