Guia para iniciantes em cromatografia de convergência

Como abordado no capítulo anterior, a CC é muito parecida com a LC do ponto de vista das separações. Mesmo do ponto de vista do equipamento, a CC lembra um sistema LC (consulte a Figura 7) em todos os aspectos, exceto por um componente adicional, o ABPR (Regulador de contrapressão automatizado, Automated Back Pressure Regulator), que pressuriza todo o sistema acima de um ponto de ajuste. Para aproveitar as vantagens da fase móvel à base de CO₂ e proporcionar os benefícios modernos da UPLC, a Waters modificou seu Sistema ACQUITY UPLC de baixa dispersão e tolerante à pressão, tornando os principais componentes dele compatíveis com um solvente compressível, como o CO_2. Em especial, isso incluía a bomba de CO₂ liquefeito para dosar o fluxo através do sistema CC. Embora o CO₂ seja primeiro liquefeito, (por exemplo, a 13 °C), ele é quase três vezes mais compressível do que o metanol ou a acetonitrila. Consequentemente, a bomba teve de ser modificada para viabilizar uma cromatografia de convergência reprodutível.

Desafios dos sistemas SFC analíticos anteriores

Historicamente, não era possível confiar nos sistemas SFC analíticos. Todos eles eram sistemas LC readaptados. As bombas, os injetores e os detectores projetados para LC não foram feitos para funcionar com CO₂ comprimido.

As bombas de LC alternativas de estágio único não conseguiam comprimir e fornecer CO₂ de maneira exata, repetidamente e com confiabilidade. Elas não são projetadas para trabalhar com um líquido tão compressível quanto o CO₂, causando variações nas taxas de fluxo de massa da fase móvel, bem como nas composições de massa. Isso altera o poder de solvatação da fase móvel e, geralmente, resulta em tempos de retenção variáveis entre uma injeção e outra ou entre sistemas.

As fases móveis baseadas em CO₂ altamente compressíveis também comprometem a sensibilidade analítica devido ao ruído gerado pela bomba e pelo regulador de contrapressão. Além disso, devido a problemas significativos de baixa exatidão e precisão utilizando injeções de loop parcial, os equipamentos de HPLC readaptados são, com frequência, restritos a injeções de loop completo, o que limita a escolha do volume de injeção. No nível dos sistemas, os sistemas HPLC readaptados apresentam um volume de dispersão do sistema significativamente maior, o que causa expansão indesejada de faixas, impedindo a utilização de colunas de partículas de 1,7 mm mais eficientes. Essas desvantagens limitam muito o desempenho possível e alcançável de um sistema LC readaptado baseado em CO₂.

A seguir, faremos uma revisão das inovações feitas em cada módulo individual do Sistema ACQUITY UPC² (Figura 7).

Tecnologia de gerenciamento de solventes (a bomba)

Para garantir um controle acurado e preciso das taxas de fluxo e da composição da fase móvel, é preciso observar todo o caminho do fluxo do sistema. Como já destacado, as bombas de HPLC readaptadas, que são projetadas para comprimir e fornecer com exatidão o volume especificado de solvente ao mesmo tempo, são incapazes de lidar com um fluido tão compressível quanto o CO₂ líquido. Em alguns equipamentos de SFC, o CO₂ de entrada passa através de um dispositivo de pré-compressão e resfriamento. Esse dispositivo fica ao lado do sistema cromatográfico (Figura 8). Quanto mais longe da bomba estiver esse dispositivo, mais difícil será controlar com exatidão a taxa de fluxo de massa de CO₂, pois a densidade do CO₂ pode mudar entre as etapas de pré-compressão e de bombeamento, dependendo da temperatura ambiente. Além disso, os algoritmos de bombeamento (software de controle interno) dos sistemas SFC tradicionais, geralmente projetados para fornecer líquidos relativamente incompressíveis, têm dificuldade de manter a exatidão da composição, a precisão e a reprodutibilidade do tempo de retenção. Os mesmos problemas ocorrem ao tentar fornecer, de maneira confiável, porcentagens baixas de cossolventes (menos de 5%), tornando difícil analisar misturas com polaridade diversa.

Por outro lado, o Gerenciador de solvente binário (BSM, Binary Solvent Manager) Waters ACQUITY UPC² foi projetado especificamente para gerenciar fluidos compressíveis com um dispositivo de pré-compressão totalmente integrado, que oferece um controle excepcional da taxa de fluxo de massa e da composição da massa. O resultado são tempos de retenção confiáveis e reprodutíveis, bem como um ruído de linha de base insignificante. Como mencionado anteriormente, em um sistema de fluido compressível, a densidade do solvente controla o poder de solvatação da fase móvel. Portanto, um controle preciso é fundamental para a reprodutibilidade. Algoritmos de controle separados, essenciais para componentes líquidos compressíveis e não compressíveis, misturam com exatidão diferentes composições de fase móvel, incluindo porcentagens baixas de cossolvente (Figura 9), e fornecem perfis de gradiente reprodutíveis (Figura 10).

Os sistemas SFC analíticos nunca alcançaram níveis tão precisos de controle, especialmente para separações de gradiente. O Sistema ACQUITY UPC² é projetado para controlar com precisão a entrada da bomba, a compressão e o fornecimento, proporcionando a reprodutibilidade esperada de um Sistema Ultra Performance LC. O controle de densidade volumétrica utilizado no BSM ACQUITY UPC² ultrapassa o controle de fluxo de massa, proporcionando uma precisão cromatográfica excepcional. Isso leva a tempos de eluição controlados e a um controle de força de solvatação excepcional. Os próprios cabeçotes da bomba são resfriados de maneira independente, o que melhora o controle da densidade de CO₂ e, consequentemente, o fornecimento de massa acurada. A bomba e os algoritmos de compressão integrados são tão eficazes, e o controle tão preciso, que é possível utilizar CO₂ líquido ou gasoso como a fase móvel inicial. A Figura 11 mostra o funcionamento interno do BSM. A bomba de cossolvente é uma bomba de UPLC, já a bomba de CO₂ fica atrás da tampa preta isolada. Como o dispositivo de compressão e resfriamento é parte integrante da bomba, essa tampa isolada permite um controle mais preciso da densidade do CO₂ de entrada.

Injeção de amostra

Os sistemas SFC analíticos tradicionais, tanto os que utilizam injetores de loop completo quanto de loop parcial, têm dificuldade em injetar volumes baixos de amostra de maneira reprodutível. Na maioria dos casos, são possíveis apenas injeções de loop completo — com injeções de loop parcial, é difícil manter a homogeneidade do solvente de injeção. Por isso, a exatidão, a precisão e a linearidade são prejudicadas, impedindo a quantificação do analito. Grandes quantidades de amostra podem ser desperdiçadas a cada injeção com tanta frequência que o loop de amostras precisa ser trocado manualmente quando necessário, limitando a flexibilidade do sistema.

O Gerenciador de amostras ACQUITY UPC² tem uma válvula de injeção dupla com um design novo (Figura 12). Isso ventila o loop de amostras primário para descarte, permitindo que a amostra entre no loop sob pressão atmosférica enquanto mantém a homogeneidade da fase móvel. Além disso, a válvula de injeção auxiliar foi projetada para reduzir os pulsos de pressão da sequência de injeção e reduzir o carryover, possibilitando injeções de loop parcial repetíveis e reprodutíveis (Figura 13). Injeções de 0,1 a 50 μL podem ser feitas em incrementos de 0,1 μL. Além disso, com as opções de lavagem de agulha dupla, o carryover de amostra é insignificante. A Figura 14 demonstra a linearidade da injeção com uma injeção de loop parcial de 1 a 10 mL e incrementos de 1 mL.

Detecção óptica

Às vezes, a detecção óptica é problemática com sistemas SFC analíticos. As células de fluxo do detector projetadas para sistemas HPLC podem levar a volumes de dispersão e ruídos de linha de base inaceitáveis. Os detectores de índice de refração, quando utilizados para SFC, causam ruído e curvatura de linha de base significativos com um fluido compressível, aumentando o ruído produzido pelo sistema de bombeamento. Solventes como metanol e água, que são comumente utilizados em RPLC, têm valores de RI (Índice de refração, Refractive Index) muito semelhantes (Figura 15). Por isso, os efeitos do RI em métodos de fase reversa normalmente não são tão significativos. O CO₂ tem um valor que é muito diferente do metanol (o cossolvente mais comumente utilizado), o que torna o intervalo de índices de refração de substâncias maior do que na LC, bem como aumenta o ruído da linha de base e limita a sensibilidade. Como um desafio adicional, a densidade e, portanto, o índice de refração de uma fase móvel baseada em CO₂ mudam ao longo de uma análise de gradiente.

O Detector PDA ACQUITY UPC² foi projetado especificamente para fluidos compressíveis. Em vez de lentes de safira, que reduzem a produção de energia em comprimentos de onda UV mais baixos, as lentes do Detector PDA ACQUITY UPC² são feitas de sílica de alta resistência, que suporta a contrapressão gerada durante uma separação. Isso ajuda a maximizar a sensibilidade, reduzir o ruído de linha de base e compensar as diferenças nos efeitos de RI entre o CO₂ e o cossolvente orgânico. A bancada óptica é controlada termicamente para melhorar ainda mais a estabilidade da linha de base e reduzir os efeitos de RI. Uma célula de fluxo de aço inoxidável de baixa dispersão acomoda larguras de pico estreitas, enquanto o comprimento de caminho de 10 mm maximiza a sensibilidade e, ao mesmo tempo, mantém o desempenho espectral ideal. O nível excepcional de sensibilidade atingível permite a quantificação de impurezas em nível de traço (Figura 16).

Detecção por Espectrometria de Massas (MS)

Semelhante aos requisitos exclusivos do equipamento para adaptar a detecção óptica para a fase móvel compressível de CC, a integração entre CC e MS requer modificações para acomodar a compressibilidade da fase móvel. A interface de CC-MS deve permitir que a fase móvel descomprima do estado pressurizado para a pressão atmosférica dentro da fonte de íons dos espectrômetros de massa atuais. Sem uma consideração cuidadosa da compressibilidade da fase móvel, o transporte de analitos para a fonte de íons pode ser afetado negativamente. Um transporte insatisfatório de analitos pode resultar em um formato de pico insatisfatório e/ou ionização inadequada. No pior cenário, não ocorrerá ionização e o analito de interesse não será detectado pelo espectrômetro de massas.

A descompressão da fase móvel comprimida deve ser controlada independentemente da taxa de fluxo da fase móvel, da composição da fase móvel e da pressão do sistema pós-coluna estabelecida pelo regulador de contrapressão automatizado (ABPR, Automated Back Pressure Regulator). Além disso, a descompressão deve ser gerenciada sem sacrificar o transporte eficiente do analito para a fonte de íons. Para atingir esses objetivos, a interface de Espectrometria de Massas do ACQUITY UPC² foi projetada para uma fase móvel compressível e emprega uma interface de fluxo de separação com um fluido complementar. A interface de Espectrometria de Massas introduz uma taxa de fluxo constante de fase móvel, normalmente entre 300 e 500 µL/min (comprimida), através do restritor de separação até o espectrômetro de massas. A porção restante da fase móvel é direcionada para o ABPR, para o controle da pressão do sistema pós-coluna em uma ampla variedade de taxas de fluxo e composições da fase móvel. Uma representação esquemática da interface de Espectrometria de Massas do ACQUITY UPC² é mostrada na Figura 17, que destaca a interface de separação e a adição de fluido complementar.

O fluido complementar exerce várias funções na interface de CC-MS. Em primeiro lugar, ele é necessário para a operação de ionização por electrospray (ESI, Electrospray Ionization) com modificador de cerca de 5%. Como a ESI é uma técnica de ionização de fase líquida, é necessária alguma quantidade de líquido para a ionização. Sendo assim, quando a porcentagem do modificador da fase móvel é muito baixa, a quantidade de líquido presente na fase móvel é insuficiente para a ESI. Portanto, a adição de líquido na forma de fluxo de complementação é necessária para ESI em porcentagens baixas de modificador. Em segundo lugar, o fluido complementar pode ajudar no transporte do analito. Em algum ponto ao longo do restritor de separação, o CO₂ fará a transição do estado denso de alta pressão para o estado de gás e perderá seu poder de solvatação. Consequentemente, depois que o CO₂ fizer a transição para um gás, apenas o modificador líquido ficará disponível para dissolver os analitos e transportá-los até a fonte de íons. Quando porcentagens de modificador iguais a zero ou muito baixas são utilizadas na separação, nenhum líquido fica disponível para transportar os analitos através do restritor de separação até a fonte de íons para ionização. O fluido complementar é adicionado a montante do restritor de separação para ajudar a transportar os analitos até a fonte de íons nessas condições. Um exemplo de perfis de pico indicando um transporte de analito satisfatório e insatisfatório é mostrado na Figura 18. Nesse caso, a taxa de fluxo do fluido complementar foi selecionada para o transporte de analito insatisfatório (18A) e satisfatório (18B).

O fluido complementar também é importante para o transporte de analitos quando o analito tem solubilidade limitada no modificador líquido da fase móvel. Às vezes, o analito é altamente solúvel na mistura de modificador líquido e dióxido de carbono comprimido, mas menos solúvel no modificador líquido sozinho. Nesses casos, pode ocorrer a precipitação do analito da solução após a transição do CO₂ para o estado gasoso no restritor de separação, mesmo quando há altas porcentagens de modificador líquido presente. Quando a solubilidade do analito no modificador líquido é insuficiente, o resultado é um formato de pico insatisfatório, entupimento da tubulação de interface e/ou reprodutibilidade de pico insatisfatória. A adição de um fluido complementar adequado pode ajudar a evitar essas dificuldades, aumentando a solubilidade do analito na mistura recém-formada de modificador líquido e fluido complementar. Por exemplo, analitos altamente lipofílicos podem ser altamente solúveis em uma fase móvel de CO₂/metanol e relativamente insolúveis em metanol sozinho. Nesse caso, um fluido complementar não polar pode ser adicionado para reduzir a polaridade líquida do modificador líquido e da mistura de fluido complementar. O analito lipofílico será mais solúvel na mistura líquida de baixa polaridade e, portanto, mais prontamente transportado até a fonte de íons.

Quando necessário, os fluidos complementares na interface de CC-MS também introduzem compostos para aumentar a ionização no espectrômetro de massas. Esses compostos podem ser adicionados após a coluna, sem afetar a separação. Compostos que aumentam a ionização, como 5% (por volume) de água e/ou 20 mM de hidróxido de amônio, ácido fórmico ou acetato de amônio, muitas vezes podem aumentar a eficiência da ionização na ESI. A concentração e o tipo de composto que aumenta a ionização são muito específicos ao analito e devem ser ajustados de acordo com cada aplicação para que seja possível obter uma resposta ideal.

Uma vez que a composição do fluido complementar é selecionada, a taxa de fluxo do fluido de complementação também pode ser ajustada para se chegar a uma resposta ideal. É possível fazer screening de várias taxas de fluxo em relação à resposta de MS. Uma taxa de fluxo muito baixa pode resultar em um transporte insatisfatório, enquanto uma taxa de fluxo complementar muito alta geralmente resulta em um sinal de MS reduzido. Juntamente com a composição do fluido complementar, a taxa de fluxo ideal do fluido complementar é específica ao analito e ao método. Para atingir a resposta máxima do sinal, eles devem ser otimizados com cada nova aplicação. Além disso, a composição do fluido complementar e a taxa de fluxo devem ser otimizadas novamente ao alternar entre técnicas de ionização — por exemplo, ao alternar de ESI para ionização química à pressão atmosférica (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation).

Em resumo, a interface de Espectrometria de Massas do ACQUITY UPC² foi projetada especificamente para uma fase móvel compressível e para fazer a integração com um espectrômetro de massas moderno utilizando técnicas de ionização por pressão atmosférica, como ESI, APCI, ionização multimodo ESCi, fotoionização à pressão atmosférica (APPI, Atmospheric Pressure Photoionisation) e UniSpray.

Regulação da contrapressão

Uma das partes mais críticas de qualquer sistema que utiliza solventes compressíveis é a capacidade de controlar e manter de maneira exata a pressão no sistema. Como vimos, o controle impreciso da contrapressão pode afetar muito a densidade da fase móvel — e, portanto, os tempos de solvatação e retenção do analito. Os sistemas SFC tradicionais muitas vezes controlam de maneira inacurada e imprecisa a contrapressão devido a vários fatores, como: monitoramento inadequado da pressão no regulador de contrapressão (ABPR, Automated Back Pressure Regulator), loops de feedback com respostas lentas, motores de passo de baixa resolução, controle da pressão e fluxo na bomba inadequados e degradação dos componentes do ABPR ao longo do tempo.

O Sistema ACQUITY UPC² conta com um controle de contrapressão aprimorado por meio de um BPR (Regulador de contrapressão, Back-Pressure Regulator) estático e um ativo de estágio duplo (Figura 19). Por meio dessa combinação de controle de contrapressão estático e ativo, o BPR estático mantém o sistema em uma pressão mínima, enquanto o BPR ativo aumenta o controle do ponto de ajuste definido pelo usuário (Figura 20). Em um esforço para melhorar ainda mais a robustez, o cartucho estático do BPR é aquecido para reduzir o congelamento da fase móvel, que pode ocorrer com uma descompressão rápida na saída do ABPR. O BPR de estágio duplo está localizado no Gerenciador de convergência (CM, Convergence Manager) ACQUITY UPC² (Figura 21). Esse módulo também abriga o filtro de partículas em linha para o CO₂ de entrada, o detector de vazamento de CO₂, a válvula de respiro, a válvula de alívio de pressão e a válvula de injeção auxiliar.

Desempenho geral do sistema

Por fim, o Sistema ACQUITY UPC² tem uma dispersão inerentemente baixa, como os sistemas ACQUITY UPLC, permitindo a utilização de colunas com diâmetro interno menor e de tamanho de partículas menores (Figura 22). Colunas com um diâmetro interno estreito aumentam a sensibilidade, conservam solvente e utilizam taxas de fluxo mais adequadas à Espectrometria de Massas. Colunas de tamanho de partículas menores aumentam a eficiência da separação e melhoram a resolução.