Guia para iniciantes em cromatografia de convergência
Introdução
Desenvolvimento da cromatografia de convergência
1.1 A cromatografia de convergência (CC) é uma tecnologia de separações que utiliza CO2 comprimido como o principal solvente na fase móvel cromatográfica, em pressões entre 100 e 400 vezes a pressão atmosférica. Na maioria das vezes, o CO2 é misturado com cossolventes líquidos (por exemplo, metanol, etanol, isopropanol, acetonitrila) para modular as propriedades da fase móvel; semelhante à maneira como esses cossolventes são misturados com água para modular as propriedades da fase móvel da cromatografia líquida de fase reversa (RPLC, Reversed-Phase Liquid Chromatography). Os familiarizados com a versão moderna da cromatografia de fluido supercrítico (SFC, Supercritical Fluid Chromatography) perceberão imediatamente a semelhança da CC com a SFC. Na realidade, a CC é uma versão renomeada da SFC moderna. Para entender o que queremos dizer, precisamos fazer uma retrospectiva histórica do desenvolvimento da SFC, o que será feito nos parágrafos a seguir.
A SFC foi inventada como uma técnica cromatográfica que emprega solventes em condições supercríticas para expandir a capacidade da cromatografia a gás (GC, Gas Chromatography). Para resolver o problema de análise de compostos que eluem apenas em altas temperaturas, mas se decompõem termicamente nessas temperaturas, Klesper e colegas empregaram pressões mais altas na GC para compensar a necessidade de altas temperaturas. As condições supercríticas foram selecionadas para (a) o poder de solvatação de um gás de alta pressão e (b) evitar condições em que as fases móveis não fluem mais como um único solvente (são submetidas à separação de fases gás-líquido) variando a pressão ou a temperatura, ou ambas. Posteriormente, eles identificaram que, variando a densidade do solvente, é possível modular a força dele, a principal vantagem de trabalhar em condições supercríticas. Como os fluidos são altamente compressíveis em condições supercríticas, mesmo pequenas alterações na pressão alteram muito a densidade do solvente e, portanto, a retenção do analito. De fato, é possível criar um gradiente de solvente variando a pressão operacional que leva à modulação da densidade, anulando a necessidade de misturar em cossolventes orgânicos para criar um gradiente. Essa possibilidade de um único modo de separação de solvente não tóxico atraiu considerável interesse e provocou entusiasmo entre os cientistas analíticos.
No entanto, o entusiasmo durou pouco, pois, gradualmente, compreendeu-se que a modulação da densidade, por mais útil que seja a técnica, pode não modificar a polaridade do solvente o suficiente para ser amplamente aplicável à variedade de compostos que podem ser separados por outras técnicas cromatográficas poderosas, como a cromatografia líquida de fase reversa (RPLC). O fato é que o CO2, identificado como o melhor solvente de escolha para a SFC, continua sendo um solvente não polar, mesmo com uma modulação de densidade significativa. Então, para separar a maioria dos analitos polares, é necessário adicionar cossolventes polares, por exemplo, o metanol. Essa constatação mudou o curso do desenvolvimento da SFC. Embora existam muitas aplicações importantes que ainda dependem apenas da modulação de densidade, os profissionais de SFC começaram a confiar mais na mistura de cossolventes orgânicos líquidos e aditivos, como na RPLC, para conseguir a separação de uma variedade maior de analitos.
O CO2 é completamente miscível com solventes muito polares (por exemplo, metanol, etanol, acetonitrila), e gradientes de solvente que atingem composições de modificadores muito elevadas (por exemplo, 60%) são utilizadas rotineiramente. Essas práticas suscitaram repetidamente questões sobre a supercriticidade da fase móvel. Em concentrações mais altas de modificador, e em temperaturas e pressões normalmente utilizadas na SFC, a fase móvel não é supercrítica durante a maior parte do tempo no método. E, acima de tudo, esses desvios das condições supercríticas não fazem nenhuma diferença na cromatografia. Então, por que uma tecnologia, que não depende de o solvente atingir uma condição supercrítica, ainda deveria ser conhecida como cromatografia de fluido supercrítico? Houve sugestões para nomear a versão moderna da SFC de outra maneira, como cromatografia de fluido sub/supercrítico, cromatografia de fluido simplificada, separações facilitadas por dióxido de carbono ou simplesmente por sua sigla (SFC), mas nenhuma faz jus ao amplo escopo de sua utilização atual em laboratórios analíticos.
Além da confusão a respeito de sua identidade, a SFC também enfrentava dificuldades tecnológicas agudas que a impediam de ser adotada como um equipamento analítico sério. A robustez e a reprodutibilidade do método eram ruins porque os instrumentos mais antigos não conseguiam lidar com um solvente compressível, como o CO2, de modo confiável e repetidamente, pelo menos no mesmo nível dos equipamentos modernos de HPLC (Cromatografia líquida de alto desempenho, High Performance Liquid Chromatography) ou UPLC (Cromatografia líquida de altíssimo desempenho, UltraPerformance Liquid Chromatography).
Tudo isso mudou quando, em 2012, a Waters Corporation introduziu a cromatografia de convergência de altíssimo desempenho (UPC2, Ultra Performance Convergence Chromatography) (consulte a Figura 1) para resolver os problemas de equipamentos e o dilema da nomenclatura. Graças à robustez significativamente maior do equipamento, que será discutida em detalhes no Capítulo 3, e um novo nome para diferenciá-lo das tecnologias mais antigas, a SFC finalmente se tornou uma opção séria para estudos analíticos.
Figura 1. O Sistema ACQUITY UPC2.
O que a palavra “convergência” significa na cromatografia de convergência?
A palavra “convergência” em “cromatografia de convergência” foi emprestada da observação de Giddings a respeito da convergência das tecnologias cromatográficas existentes — a GC e a cromatografia líquida (LC, Liquid Chromatography) — em um sistema. Giddings descreveu a SFC como uma técnica para interligar a LC e a GC e ampliar a utilização de fases móveis para além dos limites da supercriticidade. A cromatografia de convergência agora é utilizada com mais frequência com cossolventes orgânicos, abrangendo regiões supercríticas e subcríticas, o que expande os limites da modulação de densidade da SFC apenas com CO2. Mais do que apenas preencher a lacuna entre GC e LC, o potencial da SFC é muito maior do que o previsto originalmente.
