Guia para iniciantes em cromatografia de convergência

O mecanismo básico de qualquer separação cromatográfica é criar condições em que todas as moléculas do analito na mistura de amostra se movam através do sistema, mas em velocidades diferentes — de maneira que, quando eluírem da coluna analítica, elas estejam suficientemente separadas umas das outras para serem detectadas e quantificadas. Para executar esse processo, a cromatografia tem dois componentes principais: uma fase estacionária e uma fase móvel. A principal função da fase estacionária é interromper ou reter o movimento do composto, enquanto a da fase móvel é reter e também forçar os compostos a se moverem da entrada para a saída do sistema. Esse é o mecanismo fundamental da GC (Cromatografia a gás, Gas Chromatography), da LC (Cromatografia líquida, Liquid Chromatography) ou da CC (cromatografia de convergência, Convergence Chromatography). A principal diferença entre a CC e a LC ou a GC é como as propriedades da fase móvel influenciam os respectivos comportamentos cromatográficos.

Função da fase móvel em CC em comparação com LC e GC

Na GC, a fase móvel é normalmente um gás inerte ou não reativo, normalmente He ou N₂. Nas temperaturas e pressões operacionais da GC, a fase móvel não consegue solvatar as moléculas do analito nem modificar a superfície da fase estacionária. A fase móvel da GC atua principalmente como um transportador ou condutor das moléculas do analito através da coluna de GC. A retenção e a separação do analito ocorrem apenas por meio de interações entre as moléculas do analito com a fase estacionária. Isso ocorre apenas por meio de interações entre as moléculas do analito com a fase estacionária. Isso é representado na Figura 3 pelo espaço em branco ao redor das moléculas do analito.

Na LC, por outro lado, a fase móvel desempenha um papel ativo, onde as moléculas interagem fortemente com as moléculas do analito e com a fase estacionária. A fase móvel influencia a retenção do analito não apenas solvatando diretamente os analitos, mas também influenciando as interações entre o analito e a fase estacionária — competindo pela superfície da fase estacionária (Figura 3). 

A Figura 3 apresenta a LC nos modos RPLC e NPLC. Observe que uma das principais diferenças entre esses dois modos de LC está na composição da fase móvel: a RPLC é à base de água, enquanto a NPLC tem base orgânica. Na RPLC, a fase móvel à base de água, em conjunto com a fase estacionária da C₁₈, modifica efetivamente as interações que os analitos têm com a fase estacionária — desempenhando, assim, um papel importante na resolução de analitos de amostras em uma ampla variedade de misturas de compostos. No desenvolvimento de métodos RPLC, a primeira modificação geralmente é feita na fase móvel, não na fase estacionária. Na NPLC, por comparação, a fase móvel baseada em hexano ou heptano tem um papel relativamente moderado, e a separação ocorre amplamente pela variação do recheio da fase estacionária.

O papel da fase móvel na CC está em algum lugar entre a RPLC e a NPLC devido às propriedades únicas do CO₂, supercrítico ou não. O CO₂ comprimido é não polar, como o heptano ou hexano. Com base nisso, a CC é mais parecida com a NPLC. No entanto, há uma diferença fundamental: o CO₂ é capaz de se misturar completamente com cossolventes polares (por exemplo,  metanol, etanol, acetonitrila, etc.). Portanto, ele pode ser utilizado em modos de gradiente, ao contrário da NPLC, que quase sempre é utilizada no modo isocrático. Além disso, as fases móveis de CC são muito mais tolerantes à presença de pequenas quantidades de água do que as da NPLC, o que pode desempenhar um papel importante na eluição de analitos.

Na próxima seção, é apresentada uma comparação sistemática entre CC e RPLC/NPLC, com base nas diferenças de propriedade entre os principais solventes de cada técnica.

Influência das propriedades de CO2 no comportamento cromatográfico

Miscibilidade do CO2 com outros solventes

O CO₂ é um solvente não polar com um índice de polaridade semelhante ao do heptano (= 0,1). Entretanto, ao contrário do heptano, o CO₂ tem um momento de quadrupolo diferente de zero (-13·4 ± 0·4 × 10^-40 C m²) e é completamente miscível com solventes orgânicos altamente polares, como a acetonitrila (índice de polaridade = 5,8) e o metanol (índice de polaridade = 5,1). Embora seja moderadamente miscível com água (índice de polaridade = 10,2), ele é miscível com misturas de metanol/água, isopropanol/água ou acetonitrila/água com proporções consideráveis de água. Essa ampla faixa de miscibilidade permite que a fase móvel de CC estenda sua polaridade por uma faixa mais ampla do que as fases móveis de NPLC e RPLC. A Tabela 1 apresenta uma imagem concisa da situação em termos de valores eluotrópicos (força de eluição) e índices de polaridade dos solventes utilizados em RPLC, NPLC e CC.

Observe que, na Tabela 1, a fase móvel à base de água da RPLC pode empregar apenas um intervalo limitado da série eluotrópica devido à miscibilidade limitada da água com a maioria dos outros solventes orgânicos. De maneira semelhante para NPLC, a fase móvel baseada em hexano/heptano não permite um amplo intervalo eluotrópico devido à miscibilidade limitada de orgânicos não polares com solventes altamente polares. Um problema adicional com a NPLC é que nem todos os solventes orgânicos são amplamente miscíveis, mesmo uns com os outros, resultando na incompatibilidade de determinadas misturas. Na CC, por outro lado, o CO₂ comprimido é miscível com todos os outros solventes em toda a série eluotrópica, o que abre uma ampla variedade de opções na fase móvel para influenciar a seletividade das separações (consulte a Tabela 1). Embora o CO₂ seja não polar, a CC é comparável à RPLC porque pode ter uma força eluotrópica muito mais ampla, especialmente no lado da polaridade mais alta, em comparação com a NPLC. Por exemplo, combinando CO₂ com metanol, as forças eluotrópicas da fase móvel podem ser programadas de 0 a 0,73E^o.

Junto com o intervalo eluotrópico extenso, a fase móvel à base de CO₂ da CC é compatível com o maior número de recheios de fase estacionária. A Tabela 2 lista as fases estacionárias comumente empregadas para NPLC e RPLC. A maioria das separações de RPLC é realizada com fases estacionárias da C₁₈, com relativamente poucas instâncias utilizando outras fases ligadas. Algumas fases estacionárias listadas não podem ser utilizadas com RPLC devido à polaridade mais alta. Assim como na NPLC, a seleção de coluna é restringida pelo intervalo de polaridade da fase móvel. Com a CC, graças à sua faixa de polaridade mais ampla, é possível utilizar todos esses recheios de coluna, o que abre um leque mais amplo de opções de seletividade (consulte a Figura 4). Como observado por West e Lesellier, todos esses recheios podem trabalhar com a mesma composição de fase móvel, e isso abre a possibilidade empolgante de utilizar colunas de polaridades muito diferentes.

A miscibilidade do CO₂ também é importante por outro motivo: a CC é compatível com uma ampla variedade de diluentes de amostras (o solvente no qual a amostra é dissolvida ou diluída). Essa característica da CC impacta fortemente a rotina de trabalho em geral do laboratório. Frequentemente, o maior gargalo em um laboratório cromatográfico é o preparo de amostras. Os métodos de preparo de amostras mais comuns resultam na dissolução dos analitos de interesse em um solvente incompatível com o sistema LC em questão. Por exemplo, muitos analitos são facilmente dissolvidos em um solvente orgânico — e, portanto, mais bem extraídos com ele. Como grandes quantidades de solventes orgânicos são incompatíveis com a RPLC, muitas vezes são necessárias etapas adicionais para converter as soluções ou os extratos orgânicos em algo compatível com a RPLC (Figura 5). A CC é compatível com a injeção direta de amostras dissolvidas em solventes orgânicos. Isso significa que as etapas de evaporação de solventes orgânicos e a reconstituição (muito demorada) da amostra em diluentes à base de água, exigidas para separações de fase reversa, não são mais necessárias. O resultado é uma economia de custo considerável em um ensaio como um todo. Além disso, o tempo de análise pode ser muito mais curto — um impacto global significativo, especialmente para laboratórios que executam vários sistemas RPLC configurados para analisar várias amostras.

Em suma, graças à combinação de CO₂ comprimido não polar com um cossolvente em qualquer um dos extremos do espectro eluotrópico, juntamente com uma maior diversidade de fases estacionárias compatíveis com CC, é possível explorar um espaço de seletividade excepcionalmente grande, tornando a CC aplicável a uma ampla variedade de desafios de separação.

Propriedades de transporte de CO2

Outra vantagem das propriedades da CC é a baixa viscosidade e a resultante alta difusividade das moléculas dos analitos na fase móvel da CC. Do ponto de vista das propriedades físicas, a eficiência de uma coluna cromatográfica é controlada pela difusividade do analito na fase móvel. Quanto maior a difusividade de uma molécula, mais rápido ela se desloca para dentro e para fora dos poros das partículas estacionárias, resultando em uma alta eficiência, mesmo a uma velocidade elevada na fase móvel. Na CC, mesmo após a adição de volumes significativos de modificador líquido (por exemplo, para CO₂/metanol (70/30, mol/mol %), a viscosidade da fase móvel é pelo menos a metade da observada nas fases móveis de LC (consulte a Tabela 3). Isso significa que é possível operar a CC em taxas de fluxo de fase móvel muito mais altas, sem sacrificar a eficiência da coluna. Isso torna a CC uma ótima candidata para análises de alto desempenho.

É significativa a vantagem da CC em duas áreas-chave das aplicações: screenings quirais rápidos e como substituta da cromatografia de fase normal para separações aquirais. No screening quiral, o tempo de análise é reduzido de 20 minutos para apenas 3 minutos, uma diminuição de sete vezes, com um aumento na resolução. Essa melhoria é resultado principalmente da utilização de gradiente de solvente na CC, o que não é possível na NPLC. Outra vantagem da CC é o menor consumo de solvente, o que resulta em reduções de custo significativas.

A substituição de solventes orgânicos de fase normal por uma fase móvel composta principalmente de CO₂ comprimido (Figura 6) reduz o custo por análise de aproximadamente seis dólares para apenas cinco centavos por amostra. O impacto financeiro total dos tempos de análise mais curtos e da redução nos custos com a compra e o descarte de solventes é excepcional.

Papel de outras propriedades vantajosas

A Tabela 4 lista as vantagens das fases móveis de CC em relação às fases móveis de LC. Além das vantagens da miscibilidade e da baixa viscosidade, também há a baixa tensão superficial. A baixa tensão superficial permite que a fase móvel entre mais rapidamente nos poros das partículas da fase estacionária, levando a um equilíbrio mais rápido da coluna.

Outras propriedades do CO₂, que tornam a CC muito atrativa como sistema cromatográfico, é que a operação dele é mais barata, segura e sustentável. O CO₂ está prontamente disponível e não depende de nenhum outro processo crítico (por exemplo, o da acetonitrila como um subproduto da indústria petroquímica). O CO₂ de grau comercial é neutro em carbono e considerado um solvente verde. O CO₂ custa muito menos do que outros solventes orgânicos e pode ser liberado diretamente na atmosfera (se não for reciclado) sem incorrer em quaisquer custos de descarte.

O CO₂ não é inflamável, não é tóxico e é mais fácil de armazenar. É impossível encontrar uma fase móvel que combine as propriedades do CO₂ — miscibilidade e baixa viscosidade — que seja tão econômica e ecologicamente correta, o que torna a CC superior à LC para muitas aplicações. O somatório dos benefícios de todas essas propriedades, listadas na Tabela 4, torna o CO₂ um solvente único.

Supercrítica ou não?

Como explicado anteriormente, do ponto de vista cromatográfico, não importa se a fase móvel é supercrítica ou não na CC. No entanto, para realizar a separação cromatográfica, é absolutamente necessário que a fase móvel da CC seja homogênea, não uma mistura heterogênea de gás e líquido. Para garantir a homogeneidade, a fase móvel da CC é mantida acima de uma determinada pressão, que pode ser facilmente ajustada por meio de um regulador de contrapressão automatizado (ABPR, Automated Back-Pressure Regulator).