Guia para iniciantes em cromatografia de convergência

Devido à ampla seletividade da cromatografia de convergência descrita anteriormente, a técnica é adequada para uma grande variedade de aplicações (Tabela 5).

Independentemente da área do mercado ou da natureza exata dos analitos testados, a CC (Cromatografia de convergência, Convergence Chromatography) ajuda a superar os desafios analíticos de três maneiras principais:

• A cromatografia de convergência simplifica a rotina de trabalho
• A cromatografia de convergência separa os compostos com similaridade estrutural
• A cromatografia de convergência é um modo ortogonal de separação para LC (Cromatografia líquida, Liquid Chromatography) de fase reversa

A seguir, explicamos os principais benefícios da CC utilizando alguns exemplos de aplicações.

Uma das descobertas mais úteis feitas durante a evolução da cromatografia de fluido supercrítico (SFC, Supercritical Fluid Chromatography) para a CC foi como o CO₂ comprimido se mistura com uma ampla variedade de solventes orgânicos, permitindo que as análises cromatográficas sejam conduzidas de um modo que não era possível antes. Nesta seção, explicaremos como a CC pode simplificar drasticamente a rotina de trabalho em um laboratório analítico.

Em geral, a simplificação da rotina de trabalho, desde a coleta inicial de amostras até a análise final, tem o maior impacto comercial em qualquer laboratório analítico. A CC tem a capacidade de simplificar drasticamente a rotina de trabalho para muitas aplicações, resultando em economia de tempo, diminuição de custos, redução da possibilidade de erros e aumento da produtividade. Algumas dessas simplificações incluem:

• Combinação de várias técnicas (LC e GC)
• Combinação de vários métodos (LC de fase normal e LC de fase reversa)
• Redução do tempo de preparo de amostras

Combinação de várias técnicas – Análise lipídica

Analisar os lipídios é importante por vários motivos. Na indústria farmacêutica, os perfis lipídicos são estudados para determinar o impacto da eficácia dos fármacos em indivíduos nos grupos controle e de tratamento.

Na pesquisa clínica, os níveis de lipídios são estudados como biomarcadores em diferentes doenças, bem como da eficácia do tratamento. Em aplicações alimentares, determinadas classes de lipídios, como os triglicerídeos, são traçadas para fins nutricionais ou para determinar a autenticidade do produto. Em materiais químicos, os ácidos graxos e os triglicerídeos são analisados em produtos de petróleo (por exemplo, biodiesel). Dependendo do resultado desejado, a análise de lipídios requer técnicas diferentes. Para ácidos graxos livres, normalmente é a GC (Cromatografia a gás, Gas Chromatography) e requer derivatização do ácido graxo livre em éster metílico de ácido graxo (FAME, Fatty Acid Methyl Ester), para melhorar o formato de pico e os limites de detecção, especialmente para cadeias de carbono mais longas. A derivatização pode demorar várias horas, e a análise por GC resultante pode levar até trinta minutos. Mais lipídios polares, como fosfolipídios e esfingolipídios, geralmente requerem HILIC (Cromatografia de interação hidrofílica, Hydrophilic Interaction Chromatography) ou LC de fase normal para separar as diferentes classes de lipídios (com base na natureza do grupo cabeça polar). Em seguida, a LC de fase reversa é utilizada para identificar mais lipídios hidrofóbicos em uma classe com base no comprimento da cadeia de carbono e/ou no número de ligações duplas. Como é possível perceber, um perfil lipídico completo requer várias técnicas. Esse não é o caso da CC, que separa todas as classes de lipídios em uma única injeção. A Figura 40 mostra o perfil lipídico abrangente de um extrato de coração de camundongo utilizando o Sistema ACQUITY UPC². Nesse exemplo, uma coluna BEH e um gradiente genérico separam as diferentes classes de lipídios, resultando em uma separação semelhante à fornecida por HILIC ou LC de fase normal.

Para os lipídios neutros (ou seja, triacilglicerol (TG, Triacylclycerol), diacilglicerol (DG, Diacylglycerol), ésteres de colesterol (CE, Cholesterol Esters) e ácidos graxos livres), simplesmente alterar as condições de coluna e gradiente retém e separa os diferentes lipídios dentro de cada classe com base no comprimento da cadeia do ácido graxo e no número de ligações duplas (Figura 41).

A CC não é apenas mais rápida do que a cromatografia a gás (GC, Gas Chromatography) (até 10 vezes mais rápida) para essa aplicação, bem como nenhuma derivatização é necessária, o que simplifica drasticamente a rotina de trabalho em geral da análise de lipídios. A ausência de derivatização economiza tempo e minimiza possíveis erros ao adicionar essas etapas adicionais à rotina de trabalho. Sem a CC, esse tipo de definição de perfil e análise direcionada pode exigir até três técnicas diferentes, resultando em menor rendimento de amostra, maior utilização de solvente, tempos de corrida mais longos e aumento do custo total da análise.

Combinação de vários métodos de LC – Vitaminas lipossolúveis

A análise de vitaminas lipossolúveis é importante para a indústria farmacêutica, pesquisas clínicas e diagnósticos, bem como para os setores de alimentos e combustíveis. Normalmente, a análise de vitaminas lipossolúveis e carotenoides é feita por LC de fase reversa ou normal (Tabela 6). Devido à dificuldade de separação desses compostos em uma única injeção, eles são analisados individualmente utilizando diferentes colunas e fases móveis, com tempos de análise entre 10 e 30 minutos. Compare isso com a CC, que analisa todas as vitaminas e compostos relacionados em menos de 10 minutos (Figura 42). Ao contrário dos métodos tradicionais de análise listados na Tabela 6, o método simplificado da CC exige a utilização de uma única coluna, uma condição de fase móvel e um detector. Com a CC, os solventes são injetados diretamente, muitas vezes com os mesmos solventes utilizados para extrair ou dissolver esses compostos (por exemplo, isoctano e hexano), e não requer a troca de solventes, que é normalmente necessária para a análise de fase reversa.

Redução do tempo de preparo de amostras

Além de separar os analitos mais rapidamente devido à capacidade de combinar várias técnicas e métodos em um, a CC muitas vezes pode reduzir o tempo de preparo da amostra. A compatibilidade da CC com solventes orgânicos oferece os seguintes benefícios:

• Eliminação das etapas de hidrólise e/ou derivatização
• Eliminação da evaporação e reconstituição para troca de solventes
• Redução do número de etapas de manuseio, reduzindo assim erros experimentais e melhorando a qualidade dos dados 

Considere, por exemplo, as várias etapas de preparo de amostras e análises necessárias para vitaminas lipossolúveis, em alimentos. Uma rotina de trabalho de amostras típica para a análise das vitaminas A, D e E em alimentos é mostrada na Figura 43. Observe que as vitaminas A e E exigem um procedimento de preparo de amostras diferente em comparação à vitamina D. Além disso, são necessárias três análises por HPLC (Cromatografia líquida de alto desempenho, High Performance Liquid Chromatography) separadas (de fase normal e reversa) para cada vitamina. O preparo da amostra para análise da vitamina D é particularmente complexo e pode envolver muitas etapas, incluindo uma de HPLC semipreparativa em alguns casos.

O procedimento de preparo de amostras para analisar as mesmas vitaminas utilizando CC é muito mais simples (Figura 44) devido à compatibilidade da técnica com os solventes orgânicos não polares utilizados no início do processo de extração. No exemplo, injetando a amostra diretamente a partir da extração de hexano, podemos quantificar a vitamina E. Ela é, então, concentrada para a análise das vitaminas A e D3, tornando o tempo de corrida 20 vezes mais rápido do que os métodos tradicionais de análise. Além disso, a CC requer apenas três etapas de preparo de amostras, um método e um único equipamento, enquanto a rotina de trabalho tradicional mostrada na Figura 43 envolve 12 etapas de preparo de amostras e três métodos em dois equipamentos diferentes. A Tabela 7 resume as vantagens da CC nas aplicações discutidas e destaca outras em que os cientistas analíticos se beneficiariam de uma simplificação semelhante.

Separação rápida de compostos estruturalmente semelhantes

Às vezes, isômeros e análogos estruturais são difíceis de separar devido à similaridade estrutural, especialmente de isômeros ópticos. Discutiremos agora a utilização de CC para os seguintes compostos estruturalmente semelhantes:

• Separações quirais (enantiômeros e diastereoisômeros)
• Isômeros posicionais (diferindo na localização de grupos funcionais)
• Análogos estruturais
  • Biomarcadores (conjugados/não conjugados)
  • Drogas (metabólitos, impurezas, degradantes)

Frequentemente, diferentes enantiômeros de um composto podem ter perfis de toxicidade e potência variáveis. Por isso, precisam ser monitorados durante as fases de pesquisa, desenvolvimento e produção. As separações quirais são realizadas predominantemente por LC de fase normal utilizando fases estacionárias à base de celulose ou amilose. Na LC de fase normal, as separações de gradiente não são fáceis de realizar. Elas exigem análises isocráticas diferentes em colunas diferentes, com combinações diferentes de fase móvel e, muitas vezes, com solventes altamente tóxicos. O processo de desenvolvimento de métodos pode ser muito demorado. Com a CC, a capacidade de executar gradientes e abranger um amplo espaço de seletividade, com solventes não tóxicos, permite que os cientistas analíticos desenvolvam separações quirais em um único dia.

Há muitos anos, os químicos de purificação reconhecem o valor da SFC para esse tipo de separação. As separações analíticas por SFC, embora difíceis de obter, são altamente desejáveis para screenings quirais rápidos, desenvolvimento de métodos quirais, determinação de excesso enantiomérico e estudos de inversão quiral. Ao contrário da LC de fase normal, a CC é altamente compatível com a detecção por Espectrometria de Massas, proporcionando a capacidade de identificar e caracterizar enantiômeros e sua formação durante reações, processos de fabricação e em sistemas biológicos (Figura 45).

A Figura 46 compara a cromatografia de fase normal e de convergência para a separação de enantiômeros de varfarina. A linha de base de CC resolve os enantiômeros em uma fração do tempo em comparação com a fase normal (até 30 vezes mais rápido). Além disso, a eliminação de solventes tóxicos, de alto custo e descarte difícil, reduz o custo das separações quirais em até 100 vezes por análise. Todas essas vantagens tornam a CC a técnica preferida para análises quirais de todos os tipos.

Isômeros posicionais e análogos estruturais

A CC é útil para separar isômeros posicionais e outros análogos estruturais. Isômeros posicionais são compostos com o mesmo peso molecular (isobárico), mas que diferem na localização de seus grupos funcionais. Eles são frequentemente encontrados em aplicações que envolvem a análise de materiais de partida, monitoramento de reações e catálise assimétrica. Com frequência, esses compostos são derivatizados antes da análise por GC para ajudar na separação dos isômeros. Os métodos de LC de fase normal são inerentemente menos robustos e mais lentos. Por outro lado, a seletividade das separações por CC separa facilmente os isômeros posicionais sem derivatização sob um conjunto genérico de condições.

O Sistema ACQUITY UPC² (Figura 47) separa os isômeros com tanta rapidez que pode ajudar a avaliar em tempo real a otimização dos materiais de partida, intermediários e os produtos finais da reação. Os análogos estruturais são difíceis de separar por serem muito semelhantes entre si e podem incluir biomarcadores conjugados ou não conjugados (por exemplo, glucuronídeos, sulfatos), bem como metabólitos, degradantes e impurezas de compostos de medicamentos. Os esteroides são uma das classes mais populares de análogos estruturais (Figura 48). A similaridade estrutural entre diferentes esteroides dificulta a separação e a análise deles, mesmo ao utilizar a detecção por MS, devido às pequenas diferenças de massa. Com a CC, é fácil resolvê-los utilizando um gradiente de screening genérico em várias colunas e leva menos de dois minutos (Figura 49). Essa separação é um desafio para a LC de fase reversa devido à natureza não polar dos compostos. Por sua vez, a GC requer derivatização para melhorar o formato de pico e os limites de detecção. Acoplar o Sistema ACQUITY UPC² à detecção por MS é um método sólido para identificar e quantificar esteroides.

Os análogos estruturais conjugados são mais difíceis de separar. Esteroides livres (Figura 48) são insolúveis em água. Por isso, o corpo os transforma em derivados solúveis em água, convertendo-os para sua forma sulfatada. Esse processo resulta em um grupo paralelo hidrofílico carregado negativamente, tornando-os solúveis em água (Figura 50). Isolados de fontes naturais para utilização terapêutica, esses compostos são utilizados como biomarcadores para estudar doenças e determinar a eficácia de tratamentos. A análise desses compostos apresenta dois desafios principais.

Primeiro, o preparo da amostra leva 2,5 horas para uma análise por GC de 30 minutos, que requer hidrólise enzimática do grupo de sulfato seguida por derivatização. Em segundo lugar, a Espectrometria de Massas não consegue distinguir alguns desses estrogênios, pois eles são isobáricos (mesmo m/z). Assim, a cromatografia é necessária para separar as diferentes formas dos compostos isobáricos.

Com a CC, é possível separar todos os 10 estrogênios sulfatados em 15 minutos (Figura 51), incluindo dois picos em eluição próxima (picos 6 e 7), que não podem ser facilmente separados por uma análise por GC de 30 minutos (Figura 52). Com a CC, a amostra não precisa ser hidrolisada e derivatizada porque os compostos sulfatados podem ser analisados em suas formas nativas. Isso reduz significativamente a quantidade de etapas necessárias para analisar formulações terapêuticas — aumentando, assim, o rendimento e a produtividade.

A Tabela 8 resume as vantagens de utilizar a CC nas aplicações discutidas acima e destaca outras áreas de aplicação para separar enantiômeros, isômeros posicionais e análogos estruturais.

Ortogonalidade

Os modos de separação ortogonais são complementares entre si, mas exclusivos na maneira como retêm os picos de modo diferente — e, ao fazê-lo, geram mais informações sobre uma amostra do que um único modo de separação sozinho. A capacidade de resolver analitos utilizando técnicas diferentes é extremamente importante pelos seguintes motivos:

• Confiança de que é possível identificar e caracterizar uma impureza, um pico de degradação ou um composto semelhante (por exemplo, compostos isobáricos ou compostos de coeluição)
• Garantia de caracterização completa de uma amostra
• Capacidade de obter mais informações sobre uma amostra
• Separação de compostos desejados de interferências de matriz

Exemplos de técnicas de separação ortogonais incluem modos complementares, como cromatografia de fase normal e reversa. A seletividade da CC é semelhante à da cromatografia de fase normal, mas é muito mais robusta, confiável (consulte o Capítulo 2) e reprodutível do que qualquer método de fase normal. A seção a seguir mostra exemplos de como a CC é utilizada como um modo ortogonal de separação para atingir os objetivos listados acima.

A separação de um ingrediente farmacêutico ativo (metoclopramida) de suas substâncias relacionadas utilizando os Sistemas ACQUITY UPLC e ACQUITY UPC² demonstra essa ortogonalidade (Figura 53). Os picos que não são resolvidos por uma técnica são resolvidos pela outra e vice-versa. A CC é capaz de reter compostos polares por mais tempo do que a RPLC (por exemplo, picos 1 e 2). No exemplo, o Sistema ACQUITY UPC² resolve os pares críticos (pico 5 e metoclopramida), facilitando assim a purificação em maior escala e o isolamento de compostos desconhecidos para subsequente identificação e caracterização. Tudo isso torna a CC uma técnica ideal para ser utilizada em paralelo com outras técnicas de rotina com o objetivo de ajudar a resolver uma variedade de desafios de separações.

Os métodos ortogonais também são importantes para separar os analitos de interesse das interferências de matriz (por exemplo, em bioanálises ou análises de alimentos).

A Figura 54A mostra um exemplo típico de um cromatograma LC-MS/MS de clopidogrel extraído de plasma humano utilizando precipitação de proteína. Devido à hidrofobicidade do clopidogrel, a eluição dele ocorre um pouco mais tarde durante a análise. Os fosfolipídios interferentes (com um grupo cabeça contendo colina) também são eluídos nessa mesma região (Figura 54B), possivelmente causando a supressão de íons do pico de clopidogrel e uma quantificação variável. Curiosamente, os fosfolipídios interferentes são eluídos aproximadamente na mesma região no Sistema ACQUITY UPC² (Figura 54C). Devido à ortogonalidade da CC em relação à LC de fase reversa, o analito de interesse é eluído muito mais cedo e longe desses fosfolipídios interferentes (Figura 54D). Isso minimiza a chance de efeitos de matriz, garantindo uma quantificação mais acurada e precisa.

Todos esses benefícios ilustram os três principais atributos da CC, conforme mencionado anteriormente neste capítulo:

1. A cromatografia de convergência simplifica a rotina de trabalho
2. A cromatografia de convergência separa os compostos com similaridade estrutural
3. A cromatografia de convergência é ortogonal para LC de fase reversa

• Combina várias técnicas em uma
• Reduz os tempos de preparo e análise de amostras
• Pode ser utilizada para injeção direta de solventes/extratos orgânicos

• Enantiômeros (quirais)
• Isômeros posicionais
• Análogos estruturais e conjugados

• Confiança maior na identificação de impurezas/degradantes
• Caracterização completa da amostra
• Separação de analitos das interferências de matriz