Manual de espectrometría de masas

En espectrometría de masas, la capacidad de controlar los experimentos es de suma importancia. Una vez que se crea un ion en condiciones cuidadosamente controladas, debe detectarse como un evento discreto con la sensibilidad adecuada. La carga de vapor mínima hizo de la GC una primera elección ideal como tecnología acoplada, pero solo para un 20 % de los compuestos. En la actualidad, el eluyente de LC se aerosoliza con mayor frecuencia como medio de introducción de analitos para ionización en un espectrómetro de masas, una técnica que requiere un entorno de vacío para garantizar el control.

Un elemento importante del diseño de cualquier espectrómetro de masas es la capacidad de bombeo. El vacío debe estar bien distribuido en las regiones atmosféricas enrarecidas de un instrumento y debe ser suficiente para compensar necesidades de diseño como el tamaño de la entrada de iones y la cantidad de vapor que se necesita eliminar.

Los requisitos de bombeo de LC-MS dependen de la interfaz utilizada. En definitiva, esta fue una de las razones que impulsaron el desarrollo de la fuente API, donde el vapor se elimina antes de la entrada al MS.

El analizador es un instrumento para separar o diferenciar los iones introducidos. En la fuente de iones se forman tanto iones positivos como negativos (así como especies neutras no cargadas). Sin embargo, solo se registra una polaridad en un momento dado. Los instrumentos modernos pueden cambiar las polaridades en milisegundos, lo que produce registros de alta fidelidad incluso de eventos transitorios rápidos como los típicos de la cromatografía líquida Ultra Performance (UPLC) o las separaciones de GC en las que los picos tienen solo un segundo de ancho.

Cuadrupolos

En 1953, los físicos de Alemania Occidental Wolfgang Paul y Helmut Steinwedel describieron el desarrollo de un espectrómetro de masas de cuadrupolo. Se ha demostrado que los potenciales de radiofrecuencia (RF) superpuestos y de corriente continua constante (CC) entre cuatro barras paralelas actúan como un separador de masas, o filtro, donde solo los iones dentro de un intervalo de masas particular, con oscilaciones de amplitud constante, pueden acumularse en el analizador.

Los fabricantes de los instrumentos actuales los seleccionan para aplicaciones específicas. Los espectrómetros de masas de un solo cuadrupolo requieren una matriz limpia para evitar la interferencia de iones no deseados y presentan una muy buena sensibilidad.

Los espectrómetros de masas (MS/MS) de triple cuadrupolo o en tándem añaden un cuadrupolo adicional a un solo instrumento de cuadrupolo, que puede actuar de diversas formas. Una forma es simplemente separar y detectar los iones de interés en una mezcla compleja por la relación masa-carga (m/z) única de los iones. Otra forma en que un cuadrupolo adicional resulta útil es cuando se utiliza junto con experimentos de fragmentación controlada. Estos experimentos implican la colisión de iones de interés con otra molécula (normalmente un gas como el argón). En dicha aplicación, un ion precursor se fragmenta en iones producto y el instrumento MS/MS identifica el compuesto de interés por sus partes constituyentes únicas.

El analizador de cuadrupolos consta de cuatro barras, que suelen estar dispuestas en paralelo y fabricadas de metal, como aleaciones de molibdeno. Se ha invertido una gran cantidad de arte y ciencia en el desarrollo del diseño de cuadrupolos. Las masas se clasifican por el movimiento de sus iones, que inducen los campos de corriente continua (CC) y de radiofrecuencia (RF) en el analizador de un instrumento. Cambiar sistemáticamente la intensidad de campo a través del software operativo modifica el valor m/z que se filtra o se transmite al detector en un momento dado. Los cuadrupolos producen una resolución más baja que algunos diseños de espectrómetros de masas, como los instrumentos de tiempo de vuelo (TOF). Sin embargo, los cuadrupolos son instrumentos relativamente simples, fáciles de usar y muy prácticos que ofrecen una variedad de interfaces a un coste relativamente bajo.

Es necesaria cierta terminología, que se define con más detalle más adelante en este manual, para comparar y describir las capacidades de MS:

Potencia de resolución

A menudo abreviada como «res.», la potencia de resolución es la capacidad de un espectrómetro de masas para separar dos masas:

• Res. baja = unidad de masa = 1000
• Res. más alta o moderada = de 1000 a 10 000
• Res. alta = +10 000
• Res. muy alta = hasta 3-5 millones
• Un análisis más detallado de la resolución y cómo la medimos se incluye en la sección «Resolución y exactitud de la masa».

Exact Mass (Masa exacta) es el valor exacto teórico de la masa de un compuesto, mientras que Accurate Mass (Masa exacta) es el valor de masa medido para un compuesto con una barra de error asociada, como 5 ppm. Accurate Mass (Masa exacta) también se utiliza habitualmente para hacer referencia a la técnica en lugar de a la masa medida. Los criterios comúnmente aceptados para el trabajo de Exact Mass (Masa exacta) (por ejemplo, para publicar en una revista o presentar una patente) es la capacidad de derivar una medición en un instrumento dentro de los 5 ppm de su masa teórica: 5 ppm a 250 Da son 1,25 mDa (no confundirse con 5 mDa, que sería de 20 ppm a 250 Da)

MS/MS

Describe una variedad de experimentos: Monitorización de reacciones múltiples (MRM) y monitorización de una sola reacción (SRM). Es decir, monitorizar la transición de iones precursores, o fragmentaciones, a iones producto, que en general tienden a mejorar la selectividad, especificidad o sensibilidad de detección en un experimento con un instrumento de una sola etapa. Se utilizan dos analizadores de masas en serie, o dos etapas de análisis de masas, en un solo instrumento.

En un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, hay tres conjuntos de filtros de cuadrupolo, aunque solo el primero y el tercero funcionan como analizadores de masas. Los diseños más recientes han diferenciado suficientemente el dispositivo del medio (reemplazando el cuadrupolo de los diseños anteriores), lo que aumenta la función, por lo que a menudo se utiliza el término o cuadrupolo en tándem. El primer cuadrupolo (Q1), que actúa como filtro de masas, transmite y acelera un ion seleccionado hacia Q2, lo que se denomina celda de colisión. Aunque en algunos diseños Q2 es similar a los otros dos cuadrupolos, se le impone RF solo para la transmisión, no para la selección de masas. La presión en Q2 es mayor y los iones chocan con el gas neutro en la cámara de colisión. El resultado es la fragmentación por disociación inducida por colisión (CID). A continuación, los fragmentos se aceleran a Q3, otro filtro de masa de barrido, que los clasifica antes de que entren en un detector.

La disociación inducida por colisión (CID), también conocida como disociación activada por colisión (CAD), es un mecanismo por el cual los iones moleculares se fragmentan en la fase gaseosa, generalmente por aceleración por el potencial eléctrico a una energía cinética alta en la región de vacío, seguida de la colisión con moléculas de gas neutro como helio, nitrógeno o argón. Una parte de la energía cinética es convertida o internalizada por la colisión, lo que da como resultado la ruptura de enlaces químicos y el ion molecular se reduce a fragmentos más pequeños. Algunos métodos de fragmentación similares para «fines especiales» incluyen la disociación por transferencia de electrones (ETD) y la disociación por captura de electrones (ECD). Consultar la sección sobre «Métodos de ionización biomolecular».

El ion precursor de 237 Da que entra por la izquierda se fragmentó en la celda de colisión de MS/MS. El sistema de datos solo puede mostrar los fragmentos de interés (no todos los fragmentos producidos), lo que produce un espectro relativamente simple con respecto al espectro de MS de barrido completo. Se puede controlar el grado de fragmentación, al igual que la elección del ion precursor.

HPLC en fase reversa

El término fase reversa describe el modo de cromatografía, que es justo lo contrario de la fase normal, es decir, el uso de una fase móvil polar y una fase estacionaria [hidrofóbica] no polar. La figura S-2 muestra la separación de la mezcla de tres tintes negros utilizando dicho protocolo.

En algunas industrias reguladas, para cumplir con la especificación de identificación positiva de compuestos, las transiciones MRM cuentan como 1,5 «puntos de identificación», mientras que los trazados SIR cuentan como 1,0. Por lo tanto, suponiendo una selectividad suficiente, para lograr 3 «IPS», se necesitan 2 transiciones MRM pero tres trazados SIR.

El sector magnético, o un analizador de masas de campo de sector, es un diseño de instrumento temprano que persiste en la actualidad, aunque mínimamente (después de haber sido desplazado por los instrumentos ESI modernos que pueden funcionar en el modo de ionización ESI). Waters AutoSpec, por ejemplo, se utiliza universalmente para análisis de dioxinas de sensibilidad extremadamente alta.

Los sectores doblan las trayectorias de los iones en forma de arco. Las relaciones «momento-carga» de los iones determinan el radio de las trayectorias, que a su vez están determinadas por un campo eléctrico o magnético. Los iones con ratios m/z mayores atraviesan trayectorias más largas que aquellos con ratios más pequeños. Las trayectorias se controlan variando la fuerza del campo magnético. Los espectrómetros de masas de doble enfoque combinan campos magnéticos y eléctricos en varias combinaciones, aunque el sector eléctrico seguido del magnético es más común. Esta primera de las hibridaciones utiliza el sector eléctrico para enfocar los iones por su energía cinética a medida que salen de la fuente. El enfoque angular precedido por el enfoque energético produce separaciones de iones con la misma masa nominal pero diferentes fórmulas químicas.

Un instrumento de captura de iones funciona con principios similares a los de un instrumento de cuadrupolo. Sin embargo, a diferencia del instrumento de cuadrupolo, que filtra los iones en flujo, tanto el instrumento de captura de iones como el ciclotrón de iones (ICR) almacenan iones en un espacio tridimensional. Antes de que se produzca la saturación, la captura o el ciclotrón permiten la expulsión de iones seleccionados, de acuerdo con sus masas, para su detección. Se puede realizar una serie de experimentos dentro de los límites de la captura, fragmentando un ion de interés para definir mejor el precursor por sus fragmentos. Los campos generados por los voltajes de RF aplicados a una geometría apilada o en «sándwich» (electrodos en los extremos opuestos) capturan iones en el espacio entre los dos electrodos. Al aumentar o escanear el voltaje de RF, se expulsan iones de su frecuencia secular o condición capturada. El intervalo dinámico a veces es limitado. El volumen finito y la capacidad de iones limitan el intervalo del instrumento, especialmente para muestras en matrices complejas.

Los instrumentos de captura de iones se introdujeron en la década de 1980. Pero las limitaciones impuestas por el esquema de ionización interna utilizado en esos primeros instrumentos impidieron su uso para muchas aplicaciones. Solo con la llegada de la ionización externa los instrumentos se volvieron más prácticos universalmente.

La capacidad de realizar una fragmentación secuencial y, por lo tanto, obtener más información estructural de un solo analito (es decir, fragmentar un ion, seleccionar un fragmento particular y repetir el proceso) se denomina MSn. Los picos cromatográficos de GC no son lo suficientemente anchos como para permitir más de una fragmentación (MS/MS o MS2). Los instrumentos de captura de iones realizan experimentos de MS/MS o de fragmentación en el tiempo en lugar de en el espacio, como los instrumentos de cuadrupolo y sector. Por lo tanto, no se pueden usar en ciertos experimentos de MS/MS, como las comparaciones de iones precursores y pérdida neutra. Además, en el funcionamiento de MS/MS con un instrumento de captura de iones, se pierde el tercio inferior del espectro de MS/MS, como consecuencia del diseño de la captura. Para contrarrestar la pérdida, algunos fabricantes ofrecen, a través de su software, requisitos de barrido más amplios que requieren el cambio de parámetros de funcionamiento durante la adquisición de datos.

El diseño de la captura establece un límite superior en la relación entre la relación masa-carga (m/z) de un precursor y el ion producto capturado más bajo, comúnmente conocido como la «regla de un tercio». Por ejemplo, los iones producto de un ion a 1500 m/z no se detectarán por debajo de 500 m/z, una limitación significativa para la secuenciación de novo de péptidos. La captura de iones tiene un rango dinámico limitado, como resultado de los efectos de carga espacial cuando entran demasiados iones en el espacio de captura. Los fabricantes han desarrollado un barrido automatizado, que cuenta los iones antes de que entren en la captura, limitando o activando el número permitido. Todavía se puede encontrar dificultad cuando está presente una cantidad relativamente pequeña de un ion de interés en una gran población de iones de fondo.

Debido a las similitudes en el diseño funcional, los instrumentos de cuadrupolo se hibridan para incorporar las ventajas del cuadrupolo de flujo y el comportamiento de captura de iones para mejorar la sensibilidad y permitir experimentos sobre la marcha que no son posibles con ninguno de los dos. Estos instrumentos a veces se denominan capturas lineales o capturas Q El aumento de volumen de un instrumento de captura lineal (sobre una captura de iones tridimensional) mejora el rango dinámico.

Los instrumentos de captura de iones no escanean como lo hace un instrumento de cuadrupolo con la técnica de monitorización de ion único (SIM) o de registro de ion único (SIR); esta técnica no mejora la sensibilidad en las capturas de iones como ocurre en los instrumentos de cuadrupolo y sector.

Los ciclotrones de iones por transformación de Fast-Fourier (FTICR) representan la capacidad extrema de medir masas con la capacidad de resolver masas estrechamente relacionadas. Aunque no es práctico para la mayoría de las aplicaciones, un imán de 14,5 teslas puede alcanzar una resolución de más de 3,5 millones y, por lo tanto, mostrar la diferencia entre entidades moleculares cuyas masas varían en menos que la masa de un solo electrón.

Los instrumentos del ciclotrón capturan iones electrostáticamente en una celda utilizando un campo magnético constante. Los impulsos de voltaje de RF crean un movimiento iónico orbital y los iones en órbita generan una pequeña señal en las placas de detección de la celda (la frecuencia orbital del ion). La frecuencia está inversamente relacionada con el valor m/z de los iones y la intensidad de la señal es proporcional al número de iones del mismo valor m/z en la celda.A presiones de celda muy bajas, un instrumento de ciclotrón puede mantener la órbita de un ion durante periodos prolongados, lo que proporciona mediciones de muy alta resolución.

La disociación inducida por colisión de irradiación fuera de resonancia sostenida (SORI-CID) es una técnica de CID utilizada en la espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón de iones por transformación de Fourier. Los iones se aceleran en el movimiento del ciclotrón, donde el aumento de la presión produce colisiones que producen fragmentos. Después de la fragmentación, se reduce la presión y se restablece el alto vacío para analizar los iones producto.

Los instrumentos de tiempo de vuelo (TOF), aunque se desarrollaron hace muchos años, se han convertido en la base de gran parte del trabajo moderno debido a su electrónica rápida y precisa y a las técnicas de ionización modernas como la ESI. Un instrumento TOF proporciona una medición de masa exacta con unas pocas partes por millón (ppm) de la masa verdadera de una molécula. El instrumento TOF, que es un analizador de masas de dispersión temporal, se utiliza de forma lineal o, con la ayuda de rejillas y lentes electrostáticas, como reflectrón. Cuando se utiliza como reflectrón, la resolución aumenta sin perder drásticamente la sensibilidad ni tener que aumentar el tamaño del tubo de vuelo (o deriva).

Los análisis TOF implican la aceleración de un grupo de iones, en una breve ráfaga, hasta un detector. Los iones salen de la fuente y cada uno ha recibido de un electrodo «impulsor» un potencial o carga eléctrica idéntica. El potencial de cada ion se acelera o se dispara hacia un tubo de muy baja presión. Debido a que todos los iones cargados de manera similar comparten la misma energía cinética (energía cinética = ½ mv2 donde m es la masa del ion y v es la velocidad), aquellos con masas más bajas muestran una mayor velocidad y un menor intervalo antes de alcanzar el detector. Dado que la masa, la carga y la energía cinética determinan el tiempo de llegada de un ion al detector, la velocidad del ion se puede representar como v = d / t = (2 KE/m)^1/2. Los iones viajan una distancia determinada (d), en el tiempo (t), donde t depende de la relación masa-carga (m/z). Debido a que todas las masas se miden para cada «impulso», el instrumento TOF puede alcanzar una sensibilidad muy alta en relación con los instrumentos de barrido.

En la actualidad, los sistemas de MS de cuadrupolo realizan un barrido de rutina a 10 000 Da, o amu, por segundo. Por lo tanto, un barrido completo, incluso uno de corta duración (un pico de LC o GC de 1 segundo, por ejemplo) capturaría cada ion 10 veces o más en cada segundo. El detector del instrumento TOF registra los iones que bombardean la placa con una diferencia de nanosegundos entre sí. Dicha resolución ofrece las capacidades adicionales de un amplio rango dinámico y una mayor sensibilidad cuando se compara directamente con un instrumento de barrido, como un cuadrupolo. Sin embargo, el instrumento de cuadrupolo es, en general, más sensible al detectar analitos objetivo en mezclas complejas y, por lo tanto, suele ser una mejor herramienta de cuantificación. Algunos instrumentos, como las capturas de iones, ofrecen una combinación de estas capacidades. Pero hasta la llegada de los instrumentos híbridos, ninguno podía ofrecer un rendimiento de alto nivel en todos los aspectos.

Los primeros diseños de MALDI-TOF (que utilizaban ionización por desorción por láser asistida por matriz) aceleraban la salida de iones de la fuente de ionización de inmediato. Su resolución era relativamente pobre y su exactitud era limitada. La extracción retardada (DE), desarrollada para instrumentos MALDI-TOF, «enfría» y concentra los iones durante aproximadamente 150 nanosegundos después de su formación. A continuación, acelera los iones hacia el interior del tubo de vuelo. Los iones refrigerados tienen una distribución de energía cinética más baja que los no refrigerados y, en definitiva, reducen la dispersión temporal de los iones a medida que entran en el analizador TOF, lo que aumenta la resolución y la exactitud. La DE es significativamente menos ventajosa con macromoléculas (por ejemplo, proteínas >30 000 Da).

Híbridos

El término «híbrido» se aplica a varios diseños de espectrómetros de masas compuestos de tecnologías existentes, como el doble enfoque, los sectores magnéticos y, más recientemente, las capturas de iones que están «delante» de los ciclotrones. Uno de los diseños más interesantes, el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (QTOF), acopla un instrumento TOF con un instrumento de cuadrupolo. Este emparejamiento da como resultado la mejor combinación de varias características de rendimiento: medición de masa exacta, capacidad para realizar experimentos de fragmentación y cuantificación de alta calidad.

La evolución posterior ha producido el acoplamiento de las mediciones de movilidad iónica y las separaciones con la espectrometría de masas en tándem. La espectrometría de masas de movilidad iónica (nota: aquí uso 'IMMS' como acrónimo, ya que la espectrometría de masas de imágenes a menudo se abrevia 'IMS') es una técnica que diferencia los iones en función de una combinación de factores: su tamaño, forma y carga, así como su masa. Los dispositivos IMMS se utilizan habitualmente en aeropuertos y unidades portátiles de campo para detectar rápidamente (20 ms) moléculas pequeñas cuya movilidad se conoce. Por ejemplo, determinados narcóticos y explosivos. Cuando se adapta a los instrumentos de orden superior, IMMS proporciona una dimensión ortogonal de separación (tanto para LC como para MS) y algunas capacidades únicas, entre las que se incluyen las siguientes:

• Separación de isómeros, isobaras y confórmeros (de proteínas a moléculas pequeñas) y determinación de su sección transversal de colisión rotacional promedio
• Separación mejorada de mezclas complejas (por MS o LC-MS) que aumenta la capacidad de los picos y la limpieza de la muestra (separación física de iones, especialmente ruido químico, e iones que interfieren con los analitos de interés)
• Realización de CID/IMMS, IMMS/CID o CID/IMMS/CID y mejora de la cantidad de información significativa que se puede obtener a partir de experimentos de fragmentación en estudios de elucidación estructural.

En los tres escenarios analíticos, la combinación de la movilidad iónica de alta eficacia y la espectrometría de masas en tándem puede ayudarle a superar los desafíos analíticos que no podría abordar por otros medios analíticos, incluida la espectrometría de masas convencional o la instrumentación de cromatografía líquida.

El artículo de revisión de H.H. Hill Jr., et al., citado al final de esta sección, compara y contrasta varios tipos de espectrómetros de masas de movilidad iónica disponibles a partir de la publicación del artículo en 2007, y describe las ventajas de aplicarlos a una amplia variedad de analitos. Se dirige a cuatro métodos de separación por movilidad iónica que se utilizan actualmente con la espectrometría de masas:

• Espectrometría de movilidad iónica con tiempo de deriva (DTIMS)
• Espectrometría de movilidad iónica por aspiración (AIMS)
• Espectrometría de movilidad diferencial (DMS), también llamada espectrometría de movilidad iónica de forma de onda asimétrica de campo (FAIMS)
• Espectrometría de movilidad iónica de onda progresiva (TWIMS)

Según los autores, “DTIMS proporciona el mayor poder de resolución de IMS y es el único método (IMMS) que puede medir directamente las secciones transversales de colisión. AIMS es un método de separación por movilidad de baja resolución, pero puede monitorizar iones de forma continua. DMS y FAIMS ofrecen capacidad de monitorización continua de iones, así como separaciones por movilidad iónica ortogonal en las que se puede lograr una alta selectividad de separación. TWIMS es un método novedoso (IMMS) cuyo poder de resolución es relativamente bajo. No obstante, muestra una buena sensibilidad y está bien integrado en el funcionamiento de un espectrómetro de masas comercial».

Junto con la MS, la movilidad iónica también se está aplicando para investigar las estructuras en fase gaseosa de las biomoléculas. Pringle et al.(citados aquí) examinan la separación de movilidad de algunos iones de péptidos y proteínas utilizando un cuadrupolo híbrido/separador de movilidad de iones de Traveling Wave/instrumento de tiempo de vuelo de aceleración ortogonal. La comparación de los datos de movilidad obtenidos del dispositivo de separación de Traveling Wave (TWIMS) con los obtenidos con otros separadores de movilidad indica que «aunque las características de movilidad son similares, la nueva geometría del instrumento híbrido proporciona separación por movilidad sin comprometer la sensibilidad básica del espectrómetro de masas». Esta capacidad facilita los estudios de movilidad de las muestras a niveles analíticamente significativos».

Consulte también:

• Special Feature Perspective: Ion mobility-Mass Spectrometry, A. B. Kanu, P. Dwivedi, M. Tam, L. Matz y H. H. Hill Jr., J. Mass Spectrom. 2008; 43: 1-22 Publicado en línea en Wiley InterScience, (https://onlinelibrary.wiley.com/) DOI: 10.1002/jms.1383
  • Por qué es importante: una descripción general concisa de la movilidad iónica junto con la MS. Se proporcionan ciento sesenta referencias sobre espectrometría de masas de movilidad iónica (IMMS).
    
• An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/traveling wave IMS/oa-ToF instrument, S. D. Pringle, K. Giles, J. L. Wildgoose, J. P. Williams, S. E. Slade, K. Thalassinos, R. H. Bateman, M. T. Bowers, J. H. Scrivens, Published online (www.sciencedirect.com), International Journal of Mass Spectrometry (2006), doi:10.1016/j.ijms.2006.07.021
  • Por qué es importante: Describe cómo funciona IMMS con biomoléculas.