Manual de espectrometría de masas

El aumento de la resolución y la exactitud de la masa medida es ahora una herramienta dominante para la caracterización estructural en varias aplicaciones más allá del descubrimiento temprano de fármacos. Con su amplio alcance de especificidad y utilidad, los instrumentos de tiempo de vuelo de cuadrupolo (QTOF), que ofrecen varios fabricantes en la actualidad, están reemplazando otras tecnologías LCMS.

Aunque existen instrumentos de orden superior, la exactitud de masa alta de un instrumento QTOF se encuentra dentro de unas pocas partes por millón del valor monoisotópico real calculado, y su alta resolución (hasta 10 veces mayor que la de un instrumento cuadrupolo) nos permite determinar fórmulas empíricas según el defecto de masa (donde el valor de masa crítica del hidrógeno y otros átomos presentes sirven como diferenciador). El análisis de especiación (discernir la diferencia entre un aldehído y un sulfuro, por ejemplo) se hace posible con un aumento en la exactitud de la masa por encima de los límites del cuadrupolo a 30 ppm, donde las dos masas difieren en 0,035 Da. Sin embargo, la diferenciación entre los procesos metabólicos que implican la metilación es más exigente. La adición de CH₂ produce un aumento con respecto al precursor (respuesta para el fármaco solo) en la masa medida de +14,0157 Da, en comparación con una biotransformación en dos etapas que implica hidroxilación (adición de oxígeno) seguida de oxidación en un doble enlace (pérdida de H₂), lo que produce un aumento de +13,9792 Da. Sin embargo, ambas mediciones, cuando están limitadas por la resolución nominal (una respuesta típica de cuadrupolo) aparecerán como +14 Da.

Alta exactitud de masa y baja resolución

Los instrumentos de cuadrupolo de baja resolución funcionan bien para mediciones de exactitud de masa extremadamente alta, como las que se utilizan para analizar proteínas. Las masas de las proteínas se definen generalmente como valores “promedio” cuando los picos de isótopos no se resuelven entre sí. La masa promedio es la media ponderada de todas las especies isotópicas de una molécula. La resolución instrumental normalmente empleada en los instrumentos de cuadrupolo amplía la respuesta resuelta para una proteína de 10 kDa en un factor de x1,27. Ese factor aumenta significativamente a medida que aumenta la masa (por ejemplo, hasta x2,65 a 100 kDa). Sin embargo, al reducir la anchura del pico a 0,25 m/z (aumentando la resolución a 4000) en lugar de limitar la resolución del instrumento a 1000 utilizando la anchura de pico habitual (m/z 0,6), la situación mejora drásticamente.

En la práctica, los análisis ESI-MS de moléculas grandes producen iones con carga múltiple. Por lo tanto, las anchuras deben dividirse por el número de cargas de un ion para obtener la anchura en la escala de relación masa/carga. Por ejemplo, una proteína de 20 kDa con 10 o 20 cargas producirá envolturas isotópicas que sean m/z 0,9 o 0,45 unidades de ancho a m/z ~2000 o ~1000, respectivamente.

Cuando estos iones se observan en un instrumento configurado con una resolución significativamente más baja que la requerida para resolver los isótopos (por ejemplo, una resolución inferior a 10 000), se produce un solo pico para cada estado de carga. La anchura total se determina combinando la anchura del pico del instrumento con la anchura teórica del perfil isotópico dividida por el número de cargas del ion. La anchura del pico instrumental se determinaría en el primer pico isotópico de un compuesto de bajo peso molecular al mismo valor m/z que el pico de proteína con carga múltiple.

¿Cuánta exactitud necesitamos o podemos lograr de manera realista, y cuáles son los compromisos?

Tenga en cuenta los requisitos para una caracterización inequívoca de las directrices del autor del Journal of the American Society for Mass Spectrometry (marzo de 2004). Para las composiciones de C, H, O, N (C0-100, H3-74, O0-4 y N0-4), una respuesta nominal masa-carga en 118 solo necesita un error que no exceda de 34 ppm para ser inequívoca, donde una respuesta m/z a 750 requiere una precisión mejor que 0,018 ppm para eliminar “todas las posibilidades externas”.

Comparar la precisión de un instrumento a otro: Unidades de milimasa (mmu), error de medición (ppm) y resolución

De acuerdo con la Accurate Mass Best Practice Guide of the VIMMS Program, una iniciativa que forma parte del UK National Measurement System, la mayoría de los instrumentos utilizados para mediciones de masa exacta son capaces de alcanzar una precisión de 10 ppm o superior.

Una masa calculada de 118 Da medida por un espectrómetro de masas moderno con una exactitud de 2 mmu mostraría un error de 17 ppm, suficiente para los estándares actuales para la determinación inequívoca de una fórmula química de esa masa:

Masa exacta monoisotópica calculada = 118 Da

Masa exacta medida = 118,002 Da

Diferencia = 0,002 mmu

Error [diferencia/masa exacta x 106] = 17 ppm

Un instrumento capaz de dar una respuesta a 750 m/z, también deficiente en 2 mmu, tendría una exactitud de 2,7 ppm. En el primer caso, la medición es más que suficiente para la identificación inequívoca de una fórmula química, según los estándares publicados por el Journal of The American Society for Mass Spectrometry. Pero en el último caso, la medición no es lo suficientemente precisa. Solo la espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón de iones por transformación de Fourier (FTICR) de mayor orden puede lograr tal precisión a masas más altas.

Método completo para evaluar las capacidades de medición de masa exacta de un instrumento, similar al uso previsto, calculando el error de la raíz cuadrática media (RMS). Para ilustrar su uso, se ha adaptado lo siguiente de la especificación de exactitud de la medición de masas de un espectrómetro de masas TOF comercializado.

«La exactitud de la medición de masas del instrumento, en condiciones de funcionamiento normales, será mejor que un valor RMS de ppm dado en el intervalo m/z dado, basándose en un número de mediciones repetidas consecutivas de un pico de analito de m/z determinado), utilizando un pico de referencia adecuado (de m/z dado) Los picos de analitos y de referencia deben poseer la suficiente intensidad y estar libres de interferencias de otras masas».

Hay algunos puntos y suposiciones importantes que deben tenerse en cuenta:

1. Ya se ha realizado una calibración del instrumento con picos de masa conocida utilizando un patrón de calibración. El pico de referencia se utiliza para tener en cuenta cualquier variación en la calibración del instrumento a lo largo del tiempo y la exactitud de la medición de masas se determina utilizando el pico del analito.
2. Condiciones de funcionamiento normales: También pueden incluir detalles de las condiciones cromatográficas (para especificaciones de rendimiento de LC-MS) y cualquier condición de funcionamiento de MS relacionada (por ejemplo, resolución de masa, m/z de interés o velocidad de adquisición espectral).
3. Intensidad suficiente: Se presupone que el recuento de iones no es perjudicial para la caracterización de la exactitud (medición de masas) y la precisión del instrumento en cuestión. Demasiados iones producen estadísticas deficientes de iones y demasiados iones pueden provocar la saturación del detector, lo que da lugar a una mayor variación en la desviación estándar de las mediciones repetidas e influirá negativamente en el cálculo del error RMS (también relevante para la calibración del instrumento).
4. Libre de interferencias: Se presupone que la medición de la masa del pico de masa conocida está libre de interferencias de iones de masa igual o similar. La superposición de picos conduce a una exactitud deficiente de la medición de masas, lo que también es perjudicial para caracterizar correctamente la exactitud o precisión del instrumento (también es importante para la calibración del instrumento).
5. La referencia es una buena representación del intervalo m/z relevante para el análisis de un tipo de muestra concreto.

El error RMS se calcula utilizando la siguiente relación, donde E_ppm es el error en ppm y n es el número de masas consideradas:

Cabe señalar que el error RMS permite que algunas mediciones se salgan de la “ventana de interés” de error de ppm (p. ej., 5 ppm RMS). Para garantizar la calidad de las mediciones, se deben cumplir las condiciones descritas anteriormente (en particular en lo que respecta a la intensidad y la influencia de las interferencias, estadísticas de iones equilibrados con una definición clara de los picos en los espectros) en varias inyecciones repetidas. Muchos números de resolución y exactitud de masa notificados que se observan no son números de error RMS, sino que se originan a partir de un solo ion seleccionado (favorable).

Es importante recordar en todas las aplicaciones que una señal débil (resolución excesivamente alta) puede producir estadísticas de iones deficientes y, por lo tanto, puede ser inutilizable. Una señal demasiado fuerte puede ser igualmente inútil y provocar la saturación del detector. El objetivo es la estadística de iones idealmente equilibrada con definición en los espectros.

Algunas comparativas respecto a la figura:

• La resolución del cuadrupolo no es suficiente para diferenciar los dos compuestos de la figura superior.
• Con una potencia de resolución de ~5000, los datos de TOF muestran claramente dos picos distintos, cuya masa se puede medir con exactitud a <5 ppm.

Es importante apreciar las diversas funciones interrelacionadas que desempeñan en la precisión de la masa exacta el cambio entre las definiciones de masa y el aumento de la resolución y factores como la forma de los picos y la necesidad de calibración. Si no se comprenden claramente ni se tienen en cuenta, se pueden producir errores de asignación en masa y otros resultados no deseados.

Los dos fragmentos de diferentes composiciones de la figura pertenecen al mismo analito y, por lo tanto, se encuentran en la fuente al mismo tiempo. Incluso la mejor cromatografía no ayudará en este caso, por lo que enfatiza una de las razones por las que una mayor resolución es útil, especialmente en el análisis de muestras problema. Esto se aplica igualmente bien a los datos de iones producto de QTof que a los datos de iones producto de un triple cuadrupolo. Como ventaja adicional con este mayor grado de resolución, el gráfico de corriente de iones extraídos (XIC) de cada uno permite diferenciar los analitos que contienen oxígeno y que contienen alquilo de forma selectiva de los cromatogramas en los que los datos del cuadrupolo carecerían de esta capacidad.

Consultar MS - The Practical Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol. 22 n.º 2, 118-130, febrero de 2004
  • Por qué esto es importante: Trata muchos de los problemas centrales de los aspectos prácticos del uso, así como comparaciones de fuentes de la industria.
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol. 26, n.º 3, marzo de 2008
  • Por qué es importante: Analiza la utilidad de los instrumentos de mayor resolución y los compara con expectativas realistas.

También:

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004). Documento de orientación de VIMMS 2004
  • Por qué esto es importante: Una descripción general breve y concisa de los problemas críticos para el éxito con el trabajo medido y de masa exacta.
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie y D. A Volmer, Spectroscopy, Vol. 22, n.º 6, junio de 2007
  • Por qué es importante: Amplía el tema básico para incluir el defecto de masa de Kendrick y el etiquetado de péptidos y proteínas.

Sulfametazina nominal = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Masa promedio: Calculada utilizando todos los isótopos de cada elemento y su abundancia natural.

Masa promedio de sulfametazina = 278,3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Masa exacta calculada: (Monoisotópica). Determinada sumando las masas de los isótopos individuales para un ion determinado.

Masa exacta de sulfametazina = 278,0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Masa exacta: (En realidad, “masa exacta medida”). Qué hacemos con nuestros instrumentos. Es la medida de un valor de m/z expresado (normalmente) con tres o cuatro lugares decimales.

A medida que aumenta la masa, aumentan las diferencias entre las definiciones y la forma del pico juega un papel más importante:

Promedio exacto nominal de ubiquitina

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560.6254 8565.8730