Cromatografía de líquidos preparativa

Consideraciones del sistema 

Consideraciones del sistema 

Los parámetros físicos hacen que sea una decisión práctica tener un instrumento dedicado a la purificación. La automatización, las bombas, las celdas de flujo del detector, los inyectores, los tubos, las columnas y los colectores de fracciones deben tenerse en cuenta a la hora de preparar el sistema de purificación. Los sistemas modulares proporcionan la máxima flexibilidad y están diseñados para adaptarse a medida que aumentan las necesidades de rendimiento.

El nivel de automatización a menudo se basa en el flujo de trabajo y el presupuesto del usuario. Por lo general, los laboratorios universitarios y de start-ups requieren un rendimiento bajo y prefieren sistemas manuales o semiautomáticos, mientras que las grandes empresas farmacéuticas o de fabricación suelen utilizar sistemas automatizados de alto rendimiento.

Figura 22. Sistemas de mezcla de baja presión, como el módulo de gradiente cuaternario 2545 de Waters, con el detector UV/Vis 2489 y el colector de fracciones para un rendimiento bajo.
Figura 23. El sistema AutoPurification de Waters con el detector de masas ACQUITY QDa para la recolección de fracciones de alto rendimiento con detección de masas.

Software y control del sistema

Se requiere un pequeño equipo informático que controle el caudal de la bomba y la composición del eluyente en los sistemas binario, ternario y cuaternario, tanto en modo isocrático como en modo de gradiente. El software del equipo informático también registra las salidas del detector y del colector de fracciones. Dependiendo de la complejidad del paquete de software, también se puede utilizar para realizar simulaciones de desarrollo de métodos y para procesar datos.

Bombas

El sistema de suministro de eluyentes o la bomba es el núcleo de las separaciones cromatográficas. Las bombas que se utilizan para cromatografía deben proporcionar un caudal sin pulsos, exacto, preciso y reproducible, independientemente de la compresibilidad del eluyente. Se selecciona una bomba de purificación en función del caudal objetivo, que oscila entre 0,5 mL/min para una purificación a pequeña escala y 150 mL/min o más para una gran escala. Las bombas pueden mezclar los eluyentes en condiciones de alta presión (binario) o de baja presión (cuaternario).

Los módulos de gradiente binario pueden mezclar dos eluyentes diferentes que se unen en una cámara de mezcla. A esta cámara le siguen un amortiguador, un segundo mezclador y una válvula de purga. La composición del eluyente resultante se define por el flujo diferente suministrado por ambos canales de eluyente. Las bombas de mezcla de alta presión son menos sensibles a los gases disueltos en la fase móvil y, por lo general, no requieren la desgasificación del eluyente.

El resultado es una bomba con un volumen del sistema muy reducido, capaz de proporcionar un rendimiento preciso y equivalente tanto a escala analítica como preparativa.

Figura 24. El módulo de gradiente binario (BGM) de Waters es una bomba de gradiente binario de mezcla a alta presión capaz de suministrar caudales tanto analíticos como preparativos.

La bomba cuaternaria puede proporcionar un gradiente de hasta 4 eluyentes diferentes y utiliza válvulas que se abren durante períodos cortos de tiempo. Estas válvulas permiten mezclar pequeños volúmenes de diferentes eluyentes en la proporción correcta a baja presión. Con esta estrategia de bombeo, los gases disueltos pueden separarse y formar burbujas que pueden ocasionar problemas de compresión, inyección, separación y detección más adelante en la trayectoria del flujo. Por lo tanto, las fases móviles deben desgasificarse. Esto se puede lograr utilizando un desgasificador en línea, burbujeo con helio o desgasificación manual por vacío. Estas bombas proporcionan una dosificación de eluyentes muy exacta y precisa en el intervalo de flujo de operación especificado.

Figura 25. El módulo de gradiente cuaternario (QGM) de Waters es una bomba de mezcla de gradiente cuaternario a baja presión capaz de alcanzar caudales de preparación en el flujo de operación especificado.

Carga de muestras

Diámetro interno de la columna

Unidad de manejo de fluidos

Caudal máximo

µg–mg

3,9-7,8 mm

Bomba binaria de HPLC 1525*

10 mL/min

µg-10s mg

3,9-19 mm

Bomba binaria de HPLC 1525* y kit EF

22.5 mL/min

mg-10s mg

3,9-50 mm

Módulo de gradiente cuaternario 2535

50 mL/min

m-g

4,6-50 mm

Módulo de gradiente binario 2545*

150 mL/min

m-g

4,6-50 mm

Módulo de gradiente cuaternario 2545

150 mL/min

mg-10s g

7,8-75 mm

Módulo de gradiente cuaternario 2555

300 mL/min
Figura 26. Sistemas de suministro de eluyentes de Waters. * Mezcla a alta presión.

En este manual

Cromatografía de líquidos preparativa

Gradientes de exploración

Técnicas de desarrollo de métodos alternativos

Escalado de métodos

Consideraciones del sistema

Introducción de las muestras

Aislamiento del producto purificado

Notas de aplicación y referencias útiles

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