Cromatografía de líquidos preparativa

Después de que se haya desarrollado un método de separación y se haya ampliado a la escala deseada, el último paso es aislar o recoger el compuesto de interés. El usuario puede recoger las fracciones manualmente a medida que se monitoriza la elución de los picos, o la recolección de fracciones se puede automatizar en función de la señal del detector o del tiempo de retención.

Tiempo de retardo de las fracciones

La recolección de fracciones se produce cuando el detector detecta un pico que cumple los criterios que activan la recolección definidos por el usuario. Cuando el pico está presente en el detector, aún no ha viajado al colector de fracciones. Si un colector de fracciones se activa demasiado pronto, pasará por alto el pico. Se debe determinar de antemano un tiempo de retardo de fracciones específico del sistema para programar correctamente la recolección de fracciones. Un método de calibración implica inyectar un colorante concentrado y comparar el tiempo que el detector tarda en reconocerlo con el tiempo que tarda en llegar al colector de fracciones. La calibración del tiempo de retardo de las fracciones suele ser un proceso que se realiza una sola vez y, una vez introducido en el software, se puede volver a calcular para cualquier caudal. El tiempo de retardo de las fracciones se debe volver a calibrar cuando se realizan cambios en la trayectoria del flujo del detector al colector de fracciones, como cuando se añade un divisor de caudal.

Recolección manual de fracciones

La recogida manual es bastante simple y sencilla. El usuario activa el cambio de la válvula divisora en el colector de fracciones mientras la elución del compuesto se monitoriza visualmente a través de un gráfico de señales en tiempo real del software del instrumento. La recolección manual de fracciones proporciona una mayor flexibilidad porque solo se recogen las partes deseadas del análisis de purificación, pero el rendimiento tiende a ser bajo debido a la falta de automatización.

Recolección de fracciones basadas en picos

La activación basada en picos es una forma automatizada de recoger fracciones en función de una señal del detector. Los parámetros que se utilizan para decidir si un pico del cromatograma debe activar el colector de fracciones suelen ser la altura del pico, el umbral o la pendiente.

El enfoque más común para la recolección de fracciones basada en picos se basa en la altura o el umbral. La recolección de fracciones se activa en cuanto una señal alcanza la altura predefinida del detector. La recogida se detiene cuando la señal desciende por debajo de una altura predefinida.

La recolección de fracciones por pendiente suele ser un método de recogida más complicado, pero se puede utilizar para recoger picos que no están separados por la línea base. Al realizar la recolección por pendiente, el software activa automáticamente la recolección de fracciones en los puntos de inflexión matemática detectados a lo largo de la primera derivada del cromatograma.

Recolección de fracciones por detección de masas

En la recolección de fracciones basada en la masa, solo se recogen los compuestos con la masa deseada definida por el usuario. Como resultado, la recogida por masa puede ser más eficiente que la recogida basada en picos. Los requisitos para la recolección de fracciones en función de la masa se resumen de la siguiente manera:

• Se debe conocer la masa molecular del compuesto.
• El compuesto debe ionizarse para la detección de masas.

Análisis de las fracciones

Una vez que se han recogido las fracciones, se pueden analizar directamente en el recipiente de recogida o se puede eliminar el eluyente para obtener el producto purificado. Se puede utilizar un evaporador rotativo (rotavapor) para secar la fracción. Con esta herramienta, el eluyente se evapora de la muestra y la parte acuosa se liofiliza. Si se han utilizado tampones inorgánicos o si la porción acuosa es particularmente abundante, la fracción puede pasar a través de un cartucho de SPE en fase reversa para atrapar los compuestos de interés ( conocido como proceso de eliminación de sales). A continuación, los compuestos atrapados se eluyen con una pequeña cantidad de eluyente orgánico, que se puede evaporar más fácilmente.

Se puede determinar una estimación de la recuperación mediante análisis de fracciones utilizando varias técnicas analíticas de rutina, como por ejemplo: UV, IR, MS, RMN, rayos X, ensayo o elucidación de la estructura. Cuando se dispone de un patrón, es fácil hacer una comparación directa del producto aislado con los datos científicos. Sin embargo, si se desconoce el compuesto diana, se requiere un enfoque sistemático amplio e integral que implique una variedad de técnicas físicas, químicas y espectroscópicas para establecer un perfil de pureza y estabilidad.

Ecuación 14: % de recuperación

Al analizar el producto aislado, si la pureza, la recuperación o la actividad no son las esperadas, evaluar el el producto aislado en las siguientes situaciones:

• Cuando se analizan directamente desde el recipiente de recogida, se pueden formar gradientes de concentración. Como resultado, el resultado de pureza depende de dónde se extraiga la muestra en el recipiente de recogida. Las muestras deben mezclarse bien antes del análisis para lograr un resultado representativo.
• Si la muestra es más soluble en un eluyente fuerte como DMSO, pero no en fase móvil, la fracción recogida cristalizará a medida que se almacene en el recipiente de recogida con el tiempo. Si se extrae la fase líquida para el análisis de pureza y concentración, los resultados solo serán representativos de la parte soluble.
• El compuesto activo también se puede perder debido a la descomposición entre el momento de recogida, la prueba de pureza y la prueba de actividad. También se puede descomponer durante el proceso de secado. Por lo tanto, las pruebas de actividad casi siempre se realizan antes y después del secado.
• El compuesto activo se ha retenido en la columna.
• El compuesto activo es inestable en las condiciones utilizadas en el proceso de aislamiento.
• Es posible que la solución de extracción no se haya preparado en un eluyente compatible con la fase móvil, por lo que puede haberse producido precipitación.
• La mayor parte del compuesto activo se extiende a través de una amplia gama de fracciones, lo que causa que haya cantidades del compuesto difíciles de detectar presentes en las fracciones.
• La actividad del extracto podría deberse a la presencia de otros compuestos en la muestra cruda y que no están activos individualmente.
• El el producto aislado puede no ser tan puro como se esperaba si se recogió a una longitud de onda de UV en la que no se absorbieran las impurezas de elución cercana.

Si el el producto aislado no cumple los requisitos de pureza, rendimiento o recuperación de la aplicación, se puede volver a purificar utilizando el mismo método de separación o se puede desarrollar un nuevo método de separación general con una selectividad de columna diferente. El cromatografista determina el tiempo y el esfuerzo que desea invertir para que la purificación alcance los objetivos de pureza, rendimiento y recuperación deseados.